四川蒙頂山蘇云金芽胞桿菌cry基因鑒定及其新型模式cry基因的克隆與表達.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)作為一種對人畜安全、無環(huán)境污染的微生物殺蟲劑，在農(nóng)、林及衛(wèi)生害蟲的防治中發(fā)揮了重要的作用，成為國內(nèi)外開發(fā)應(yīng)用最成功的一種微生物農(nóng)藥。因此深入發(fā)掘我國豐富的Bt資源，篩選具有高效廣譜殺蟲活性的Bt菌株，并對其基因型進行分析，克隆新型殺蟲基因，這對微生物殺蟲劑的研制、構(gòu)建高效廣譜工程微生物和培育轉(zhuǎn)基因抗蟲植物都具有重要的理論及實踐意義。本研究對四川雅安蒙頂山土壤中Bt資

2、源進行了較為系統(tǒng)地調(diào)查研究，從中克隆到一個新的cry2型模式基因，并對其進行了初步的表達研究，研究如下：
　　 1.根據(jù)海拔高度和生態(tài)環(huán)境的不同，從蒙頂山采集了285份土壤樣本，采用醋酸鈉-抗生素法對土樣中Bt菌株進行分離，獲得78株Bt菌株。土樣中Bt菌的平均分離率為19％。顯微鏡觀察顯示，分離出的Bt菌株產(chǎn)生形態(tài)各異的伴胞晶體，有長菱形、短菱形、球形、方形、不定形等，充分顯示了蒙頂山生態(tài)區(qū)Bt資源多樣性的特點。利用PCR-R

3、FLP鑒定體系鑒定了78株Bt菌的殺蟲晶體蛋白基因類型：其中68株含有cry1型基因，28株含有cry2型基因，2株含有cry3型基因，2株含有cry9型基因，3株含有cry4/10型基因，3株含有cry30型基因。用SDS-PAGE對這些菌株的殺蟲晶體蛋白進行分析，結(jié)果表明：這些菌株主要表達4種大小的晶體蛋白，分子量在40-130kDa之間。對于沒有擴增產(chǎn)物的Bt菌株，其SDS-PAGE分析卻檢測到晶體蛋白，由此可推測，這些菌株中可能

4、含有新型的殺蟲基因。
　　 2.用cry2型基因的通用引物鑒定出28株含有cry2型基因的Bt菌株，再用DdeⅠ內(nèi)切酶分別對它們的擴增產(chǎn)物進行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株JF19-2的擴增片段的酶切產(chǎn)物大小與已知的cry2型基因的酶切片段大小存在差異，說明JF19-2中可能含有一個新的cry2型模式基因。
　　 3.根據(jù)cry2型基因的通用引物對菌株JF19-2的擴增序列，在序列的上游和下游分別設(shè)計特異引物SP1和SP2，采

5、用Tail-PCR技術(shù)獲得兩側(cè)的未知序列，將擴增序列克隆并測序，測序結(jié)果與已知序列進行拼接，得到了3，285bp的核苷酸序列，其中含有一個長1，905bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一個由635個氨基酸組成的蛋白，分子量為70.8kDa，等電點為9.18，該蛋白為弱堿性蛋白，其中異亮氨酸(Ile)、天冬酰氨(Asn)、色氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)四種氨基酸含量最高，分別為11.2％、10.57％、9.94％和8.36％。氨基酸同源

6、性比較發(fā)現(xiàn)，其與Cry2Ab1蛋白同源性最高，為92％。該新基因已在GenBank中注冊，其Accession number為ACH91610，被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會命名為cry2Ag1。
　　 4.根據(jù)cy2Ag1基因ORF兩端序列，設(shè)計一對特異引物P1和P2。PCR擴增獲得cry2Ag1完整ORF。將獲得的片段經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切，與構(gòu)建的大腸桿菌表達載體pET-22b(+)連接，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET