奶牛β-防御素TAP基因克隆及乳腺特異性表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、防御素在機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用。乳腺炎可誘導(dǎo)奶牛乳腺組織中β-防御素增量表達(dá)，使患乳腺炎局部防御作用增強(qiáng)，表明在乳房炎的發(fā)生和防御過程中β-防御素發(fā)揮重要的作用。用乳腺生物反應(yīng)器制備目的藥用蛋白是目前生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)，但外源蛋白在乳腺組織中特異、高效表達(dá)受諸多因素影響，仍需進(jìn)一步研究。本研究克隆了奶牛乳腺組織中β-防御素氣管抗菌肽(TAP)基因，構(gòu)建TAP基因真核表達(dá)質(zhì)粒；進(jìn)一步用奶牛β-乳球蛋白(BLG)基因啟動(dòng)子

2、和5'端調(diào)控序列構(gòu)建TAP基因乳腺特異性表達(dá)載體，并初步進(jìn)行了表達(dá)。
　　 1.利用PCR方法從奶?；蚪MDNA中擴(kuò)增BLG基因5'端調(diào)控序列(3114bp),其中包含第一、二個(gè)外顯子和內(nèi)含子，將其插入pMD19-T simple載體。序列分析表明，克隆的序列和原序列相似性為97％，包含多個(gè)乳腺特異性表達(dá)調(diào)控元件，可用于構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體，調(diào)控外源目的蛋白表達(dá)。
　　 2.采用RT-PCR方法從奶牛乳腺組織中擴(kuò)增氣管

3、抗菌肽(TAP)基因，重組到pMD19-T simple載體中進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示，克隆的TAP基因包含完整的開放閱讀框(ORF)195bp，與牛TAP基因相似性達(dá)93.8％；該ORF編碼的64個(gè)氨基酸，含有β-防御素特征性結(jié)構(gòu)即6個(gè)在特定位置上的保守半胱氨酸殘基。TAP基因cDNA完整開放閱讀框的克隆，為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用重組牛β-防御素奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.將克隆的奶牛BLG5'端調(diào)控序列與酶切回收的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-

4、C1連接，取代原表達(dá)質(zhì)粒中CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建pBLG-EGFP-C1通用乳腺特異性表達(dá)載體。酶切回收TAP基因序列，分別插入真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1和構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)質(zhì)粒pBLG-EGFP-C1的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建TAP基因的兩種表達(dá)質(zhì)粒：pEGFP-C1-TAP和pBLG-EGFP-C1-TAP。
　　 4.運(yùn)用奶牛乳汁分離培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞和組織塊法培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，將構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)質(zhì)粒pBLG-EGFP-

5、C1-TAP脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染原代乳腺上皮細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察與TAP基因融合表達(dá)的綠色熒光蛋白。72h時(shí)觀察到融合表達(dá)的綠色熒光蛋白。
　　 5.將pEGFP-C1-TAP質(zhì)粒脂質(zhì)體包埋，轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察與TAP基因融合表達(dá)的綠色熒光蛋白，并用RT-PCR法檢測(cè)COS7細(xì)胞中奶牛TAP mRNA的表達(dá)情況。72h時(shí)觀察到融合表達(dá)的綠色熒光蛋白，并在COS7細(xì)胞中檢測(cè)到奶牛TAP mRNA的轉(zhuǎn)錄。

6、>　　 6.脂質(zhì)體包埋pBLG-EGFP-C1-TAP和pEGFP-C1-TAP質(zhì)粒，分別注射于泌乳期母兔乳腺組織中，運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)相應(yīng)母兔乳腺組織中奶牛TAP mRNA的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)TAP mRNA在兔乳腺組織中得到表達(dá)，與pEGFP-C1-TAP質(zhì)粒處理母兔的乳區(qū)相比，pBLG-EGFP-C1-TAP質(zhì)粒處理母兔乳區(qū)TAP表達(dá)量提高。證明構(gòu)建的TAP基因乳腺特異表達(dá)質(zhì)?？稍谌橄俳M織中表達(dá)，為進(jìn)一步研制防御素的乳腺生物反應(yīng)