產(chǎn)酶芽孢桿菌的篩選、鑒定及對(duì)肉雞的微生態(tài)效應(yīng)研究.pdf

1、本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離保存的芽孢桿菌進(jìn)行產(chǎn)酶活性篩選，并對(duì)篩選得到的一株產(chǎn)酶活性高的芽孢桿菌進(jìn)行16S rDNA序列分析鑒定，研究其對(duì)雄性小鼠的生殖系統(tǒng)安全性、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)在肉雞腸道中消長(zhǎng)規(guī)律、ERIC-PCR和PCR-DGGE檢測(cè)肉雞口服該菌懸液后腸道菌群多樣性，然后制成活菌制劑觀察其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、肌肉品質(zhì)、腸道菌群、消化酶活性和免疫功能的影響。結(jié)果如下：
　　 1.采用平板培養(yǎng)法對(duì)10株芽孢桿菌產(chǎn)

2、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶活性進(jìn)行初選，然后采用比色法測(cè)定芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液酶活性進(jìn)行復(fù)選。篩選出產(chǎn)酶活性較高的芽孢桿菌Pab02菌株。根據(jù)細(xì)菌的16SrDNA序列兩端的保守性設(shè)計(jì)通用引物，提取菌株的基因組DNA，對(duì)菌株的16SrDNA的進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并列擴(kuò)增得到的目標(biāo)片段進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI上己知菌種的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化特性，最終確定芽孢桿菌Pab02為枯

3、草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。
　　 2.為了評(píng)價(jià)該菌的安全性，選用72只昆明系雄性小鼠，隨機(jī)分成6組。藥物對(duì)照組，每只小鼠按20mg/kg體重經(jīng)口灌喂環(huán)磷酰胺，1次/d，連續(xù)5d，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生生殖毒性；藥物對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠飼喂不含任何益生菌和抗生素的日糧，芽抱桿菌Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組分別飼喂含有105，106，107CFU/g和108CFU/g的飼料。飼喂至30d時(shí)，每組隨機(jī)剖殺6只，檢測(cè)小鼠睪丸、

4、附睪重，精子畸形、精子活力，睪丸組織中MDA含量和SOD活性，精子頂體酶活力，血清睪酮(T)含量，并通過(guò)組織切片觀察雄性小鼠睪丸的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，芽孢桿菌Pab02對(duì)小鼠體重、小鼠睪丸和附睪重均有明顯的增重效果；芽孢桿菌Pab02可提高小鼠精子活率，對(duì)精子畸形的減少?zèng)]有明顯的作用；芽孢桿菌Pab02可降低小鼠睪丸組織中MDA含量，提高睪丸組織中SOD活性、精子頂體酶活力和血清睪酮的含量，芽孢桿菌Pab02對(duì)小鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)有一定的

5、改善作用。結(jié)果表明，芽孢桿菌Pab02對(duì)雄性小鼠是安全的，沒(méi)有造成生殖毒性，對(duì)雄性小鼠生殖功能有一定的促進(jìn)作用。
　　 3.芽孢桿菌Pab02菌懸液按2m1/kg體重(109CFU/ml)灌喂28日齡的肉雞，2次/d，連續(xù)3d后，收集腸道內(nèi)容物，采用RT-qPCR檢測(cè)腸道內(nèi)容物中芽孢桿菌的數(shù)量。結(jié)果，對(duì)照組（灌喂等量的PBS液）肉雞腸道內(nèi)芽孢桿菌數(shù)在5.37～6.10 log Copies/g之間，當(dāng)連續(xù)口服芽孢桿菌Pab02菌

6、懸液后，十二指腸內(nèi)的芽孢桿菌數(shù)量從12h到第4d顯著高于對(duì)照組，第5d后恢復(fù)到對(duì)照組水平；空腸、回腸和直腸從12h到第5d顯著高于對(duì)照組，第6d后恢復(fù)到對(duì)照組水平。盲腸內(nèi)的芽孢桿菌數(shù)量在36h和60h時(shí)顯著高于對(duì)照組。結(jié)果表明，芽孢桿菌在對(duì)照組肉雞腸道中的數(shù)量較少，芽孢桿菌Pab02作為微生態(tài)制劑飼喂動(dòng)物，須長(zhǎng)期投服或間斷時(shí)間不超過(guò)3d。
　　 4.芽孢桿菌Pab02菌懸液連續(xù)灌喂28日齡肉仔雞3d后（2次/d），收集停喂3d的

7、腸道內(nèi)容物，采用ERIC-PCR/PCR-DGGE方法分析電泳指紋圖譜條帶數(shù)及相似性指數(shù)，以及對(duì)DGGE特異性條帶回收、測(cè)序分析其腸道菌群。結(jié)果顯示，兩種方法都證明肉雞口服芽孢桿菌Pab02后各腸段的條帶數(shù)及特征性條帶均明顯多于對(duì)照組，說(shuō)明芽孢桿菌Pab02具有提高肉雞腸道菌群多樣性和種群密度；通過(guò)對(duì)電泳指紋圖譜條帶的聚類分析，兩種檢測(cè)方法顯示肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性變化規(guī)律相似，兩組肉雞腸道細(xì)菌之間存在著種群的差異性，但兩組之間腸道總

8、菌群的相似性系數(shù)為53.2％，存在著較高的相似性，說(shuō)明該年齡段的肉雞腸道微生物種群存在著一定的穩(wěn)定性；盡管兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果存在著一定的相似性，但從電泳指紋圖譜和統(tǒng)計(jì)條帶數(shù)量分析，PCR-DGGE明顯優(yōu)于ERIC-PCR;通過(guò)對(duì)DGGE圖譜上出現(xiàn)的7條共同條帶和8條試驗(yàn)組條帶進(jìn)行回收鑒定，結(jié)果表明，肉雞在4周齡到5周齡的肉雞腸道中主要以乳酸菌為主要菌群，飼喂芽孢桿菌Pab02后能提高肉雞腸道菌群的豐度和種群密度。
　　 5.利

9、用芽孢桿菌Pab02制成活菌制劑后飼喂肉雞，觀察其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、肌肉品質(zhì)、腸道菌群、消化酶活性及免疫功能的影響。空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，抗生素對(duì)照組在日糧中添加0.05％的硫酸新霉素制劑，Pab02組在日糧中添加0.1％的芽孢桿菌Pab02制劑。飼喂至6周齡時(shí)，與空白對(duì)照組相比，芽孢桿菌Pab02提高了肉雞的末期體重、凈增重和日增重（P＜0.05），但比抗生素組低（P＞0.05）；對(duì)采食量和飼料轉(zhuǎn)化率沒(méi)有影響(P＞0.05);Pab0

10、2組肉雞胴體品質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)與兩對(duì)照組相比，顯著提高了腿肌率(P＜0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯差異(P＞0.05);Pab02組雞肌肉中的蛋白含量顯著高于兩對(duì)照組(P＜0.05)；肌肉中的氨基酸總量和鮮味氨基酸含量極顯著高于兩對(duì)照組(P＜0.01)，必須氨基酸量極顯著高于抗生素組(P＜0.01)；在6周齡時(shí)，芽孢桿菌Pab02可以提高腸道中乳酸菌的數(shù)量，減少大腸桿菌和總需氧菌數(shù)量，在盲腸段中表現(xiàn)差異顯著(P＜0.05)；在4周齡和6用齡