花生防御素基因AhDRRP抗黃曲霉功能分析.pdf

1、黃曲霉毒素（AFT）是迄今毒性最強的一類生物毒素，具有致畸、致癌和致誘變作用，對人和動物具有強烈的毒性，其中黃曲霉毒素B1更被稱為第一大類致癌物，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。花生是最容易感染黃曲霉毒素污染的作物之一?；ㄉS曲霉毒素污染已成為全球花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因子。近年來，各國加大對花生黃曲霉毒素預(yù)防和控制力度，并實施嚴(yán)格的安全限量標(biāo)準(zhǔn)。解決花生黃曲霉毒素有許多途徑，目前國內(nèi)外認(rèn)為培育抗性品種是解決花生免受黃曲霉毒素污染的最有效和最

2、經(jīng)濟途經(jīng)。
　　 本論文在前期抗黃曲霉相關(guān)基因篩選的基礎(chǔ)之上，采用基因克隆、原核表達、亞細胞定位、實時定量PCR、以及遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)，分析花生防御素基因抗黃曲霉侵染和產(chǎn)毒功能。
　　 實驗結(jié)果表明：
　　 1、采用RACE方法克隆花生防御素基因全長cDNA序列，并命名為AhDRRP。經(jīng)序列分析，該基因序列全長558bp，含一個225bp的開放閱讀框。該基因編碼一個由75個氨基酸組成的蛋白，其中蛋白的分子量為8.3

3、 kDa，pI 5.03。預(yù)測分析表明花生防御素蛋白N端含有一個信號肽，含有保守的8個半胱氨酸及防御素基因共有的Gamma-thionin結(jié)構(gòu)域。克隆得到的花生防御素基因組序列為225bp，測序表明其cDNA全長與基因組全長序列一致。
　　 2、構(gòu)建pET32a-AhDRRP原核表達載體，經(jīng)誘導(dǎo)獲得原核表達AhDRRP融合蛋白。通過鎳柱親和層析后，獲得純化的28KD的AhDRRP蛋白。體外抑制黃曲霉試驗表明：純化的AhDRRP蛋

4、白在體外能抑制黃曲霉生長的效果。
　　 3、構(gòu)建了AhDRRP-GFP載體，并對其亞細胞定位進行分析，結(jié)果表明，AhDRRP主要定位在細胞壁。
　　 4、采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究抗黃曲霉花生品種（粵油20）和易感黃曲霉品花生品種（粵油7）在正常生長、干旱處理、干旱處理同時人工接種黃曲霉三個處理情況下AhDRRP變化。結(jié)果顯示：在干旱和黃曲霉菌人工接種處理下，抗性品種中AhDRRP基因表達顯明顯上調(diào)，其上調(diào)量是感病品

5、種的8倍，表明該基因的上調(diào)表達與品種的抗性相關(guān)。
　　 5、構(gòu)建pCAMBIA1301-AhDRRP花生超表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化，獲得經(jīng)PCR驗證的AhDRRP超表達花生植株4株，采用室內(nèi)人工接種和ELISA KIT方法檢測對超表達轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，結(jié)果顯示AhDRRP超表達植株的種子抗黃曲霉侵染能力顯著高于轉(zhuǎn)空載體的種子和未轉(zhuǎn)基因種子，但黃曲霉毒素含量與轉(zhuǎn)空載體和未轉(zhuǎn)基因的種子毒素含量差異不顯著，表明AhDRRP基