激活蛋白AP-2asiRNA電轉(zhuǎn)染牛雙核滋養(yǎng)層巨細(xì)胞對(duì)其特異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響.pdf

1、為探討轉(zhuǎn)錄激活蛋白2α(activator protein-2α,AP-2α,TFAP2A)對(duì)牛雙核滋養(yǎng)層巨細(xì)胞(binucleate trophoblast giant cells,BNC)特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)了牛原代滋養(yǎng)層巨細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行了核染色和細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定,以建立細(xì)胞模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。采用電轉(zhuǎn)技術(shù)將化學(xué)合成AP-2αsiRNA導(dǎo)入原代細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)干擾效率,采用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活

2、率,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以找到最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)；采用熒光定量PCK檢測(cè)AP-2αsiRNA對(duì)內(nèi)源TFAP2A的干擾效率,篩選出最佳干擾位點(diǎn)；最后采用熒光定量PCR分別檢測(cè)干擾后BNC特異表達(dá)基因Csh1、PRP-Ⅰ和PAG1的mRNA水平。
　　 本研究主要分為兩個(gè)部分:
　　 一、牛滋養(yǎng)層巨細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　 取懷孕牛45-60天的完整子宮,無(wú)菌條件下收集胚胎子葉,Ⅰ型膠原酶消化分離細(xì)胞后采用Percoll細(xì)胞分離液純

3、化滋養(yǎng)層細(xì)胞。用含15％胎牛血清和滋養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(trophoblast growth supplement,TGS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,并用差異貼壁法再次進(jìn)行純化。采用臺(tái)盼藍(lán)和Hoechst33342細(xì)胞染色液對(duì)細(xì)胞活力及形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析。采用波形蛋白和角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)分離的細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞存活率大于90％,用Percoll細(xì)胞分離法純化后BNC的純度可達(dá)30％,細(xì)胞培養(yǎng)10天后,BNC占

4、細(xì)胞總數(shù)的45-50％。抗細(xì)胞角蛋白抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性,抗波形蛋白抗體檢測(cè)呈陰性,經(jīng)核染可見(jiàn)典型雙核特征。本實(shí)驗(yàn)建立了一種相對(duì)快速、簡(jiǎn)便、能夠培養(yǎng)相對(duì)較高純度的牛原代胚胎滋養(yǎng)層巨細(xì)胞的方法。
　　 二、AP-2αsiRNA電轉(zhuǎn)染原代BNC細(xì)胞
　　 培養(yǎng)后第10天收獲細(xì)胞,將化學(xué)合成的AP-2αsiRNA干擾鏈,采用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染入純化后的BNC,首先轉(zhuǎn)入帶熒光標(biāo)記基團(tuán)的siRNA(NC-siRNA-FAM),4小時(shí)后用流式細(xì)胞

5、儀和臺(tái)盼藍(lán)染色分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活率。再轉(zhuǎn)入不同位點(diǎn)的干擾鏈,48小時(shí)后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AP-2αmRNA水平,以篩選出最佳干涉位點(diǎn)。以最佳干涉位點(diǎn)的siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn),即轉(zhuǎn)入該siRNA干擾鏈,48小時(shí)后RT-PCR測(cè)定Csh1、PRP-Ⅰ和PAG1的mRNA水平。本研究采用電轉(zhuǎn)染方法,結(jié)果顯示,最佳優(yōu)化條件為:細(xì)胞密度調(diào)整為500μl PBS含2×106個(gè)細(xì)胞,加入6μgNC-siRNA-FAM,電轉(zhuǎn)參數(shù)為2×120V,

6、2ms。在此參數(shù)下陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)到93.5±1.66％,且細(xì)胞存活率為78.56±5.93％。初步建立了有效的siRNA電轉(zhuǎn)入牛滋養(yǎng)層巨細(xì)胞的方法。PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組和ns-siRNA組相比,AP-2αsiRNA干擾效率可迭72.30±3.28％,差異極顯著(P<0.01),轉(zhuǎn)染后內(nèi)源性Csh1和PRP-Ⅰ的mRNA水平分別下降了65.45±6.38％,40.73±11.72％,差異極顯著(P<0.01)；而PAG1的mRNA水平減