真姬菇農桿菌介導轉化Hsp70基因.pdf

1、真姬菇（Hypsizygusmarmoreus）是一種珍稀食用菌，屬于中偏低溫型食用菌。菌絲生長溫度5～30℃，最適20～25℃，超過35℃或低于4℃時菌絲不再生長，在45℃以上無法存活，溫度過高或過低都會對真姬菇的生產造成較大影響。因此，真姬菇新品種（高抗菌株）培育成為真姬菇生產和科研中的一個重要課題。熱激蛋白(heatshockprotein，HSP)是一類在有機體受到高溫等逆境刺激后大量表達的蛋白，是生物對逆境脅迫短期適應的必需組

2、成成分，對減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。熱激蛋白一旦在體內形成，生物體就會盡快地適應外界環(huán)境，表現(xiàn)出很強的抗逆性。因此，熱激蛋白基因是育種工作中具有重要實用價值的優(yōu)良基因。
　　 在本實驗室已經成功克隆出Hsp70基因（GenBank登錄號為GQ246176，全長共2308bp，開放性閱讀框共2001bp，編碼666個氨基酸）的基礎上，本項研究構建了Hsp70基因的真姬菇表達載體PHspHyg;然后將Hsp70基因轉入真姬

3、菇基因組中，成功獲得了轉Hsp70基因真姬菇菌株，并檢測出Hsp70基因在真姬菇中的高效表達。主要研究成果如下:
　　 1.以質粒pROK2為出發(fā)質粒，通過PCR擴增出完整的Hsp70基因，并在其兩側加上KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點，回收該片段后，將其插入質粒pROK2的多克隆位點處，獲得重組質粒PHsp;然后在此基礎上，限制性內切酶HindⅢ和NheⅠ雙酶切重組質粒PHsp，回收質粒大片段，通過PCR將質粒pCAMBIA1301

4、中的Hyg表達框完整擴增出來，并在其兩側加上HindⅢ和NheⅠ酶切位點，回收該片段后，與酶切后質粒PHsp的大片段相連接，獲得重組質粒PHspHyg。成功構建了Hsp70基因的真姬菇表達載體。
　　 2.通過對真姬菇的潮霉素抗性試驗，確定了真姬菇G12的潮霉素致死濃度應該在20μg/ml左右，據此將農桿菌轉化的初篩濃度定為20μg/ml，復篩濃度定為25μg/ml。通過Cefotaxime對真姬菇的毒性試驗，結果表明，Cefo

5、taxime對真姬菇G12的菌絲生長基本沒有影響，從而確定了Cef的最佳抑菌濃度為200μg/ml。
　　 3.本實驗采取農桿菌介導的方法將Hsp70基因真姬菇表達載體PHspHyg轉入真姬菇G12中，使得Hsp70基因表達框整合到真姬菇的基因組DNA中。通過對潮霉素抗性轉化子的驗證，證明成功獲得了轉Hsp70基因真姬菇菌株。
　　 4.通過對已經成功獲得的真姬菇轉化子菌絲，進行45℃高溫不同時間的熱激處理試驗，結果表明

6、，真姬菇轉化子的菌絲對高溫熱激處理比真姬菇對照組的菌絲有較好的耐熱性;SDS-PAGE電泳檢測高溫熱激處理后的真姬菇轉化子的菌絲蛋白，結果表明真姬菇轉化子的蛋白在90KDa的表達量要大于對照組真姬菇，結果與我們預計的一樣。說明我們構建的真姬菇轉化子可以提高熱激蛋白的表達量，增強真姬菇對高溫的應激性。
　　 本試驗研究結果對通過分子生物學技術提高食用菌對高溫的應激性提供了良好的思路，對農業(yè)栽培食用菌與現(xiàn)代生物學技術相結合應用有更好