家蠶中腸上皮細胞的增殖與分化——家蠶中腸干細胞的初步識別和鑒定.pdf

1、干細胞是一類具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細胞群體,目前針對昆蟲干細胞的研究,是生物學領域的熱點之一.腸道易受到各種損傷因子的侵襲,為使生命及新陳代謝過程有序進行,中腸組織內的細胞需要發(fā)生持續(xù)不斷地更替,該過程主要依賴位于中腸上皮層內中腸干細胞(intestinalstemcell,ISC)的自我更新和增殖分化。解析中腸組織結構和鑒定中腸干細胞,是研究中腸干細胞維持及分化調節(jié)機制的基礎,進而對揭示昆蟲生長及變態(tài)發(fā)育和代謝調控機理

2、有重要意義,同時也為脊椎動物中腸干細胞的相關研究提供理論依據。
　　 家蠶屬于完全變態(tài)昆蟲,是鱗翅目類昆蟲的典型代表,蠶的細胞遺傳和連鎖分析等研究較為深入,但對其中腸干細胞的研究目前還鮮有報道。家蠶的中腸上皮層組織在每個齡期蛻皮前都要發(fā)生大規(guī)模的更新,同時伴有組織重構,家蠶中腸干細胞直接參與該過程。
　　 本文觀察和分析了家蠶中腸在不同齡期的組織結構的動態(tài)變化,并通過免疫熒光的方法檢測家蠶中腸上皮細胞的增殖和有絲分裂,主

3、要研究結果如下:
　　 1,形態(tài)學分析系統觀察家蠶中腸組織結構在其生長發(fā)育及變態(tài)過程中的動態(tài)變化
　　 家蠶各齡期的中腸組織經改良bouin液進行固定,石蠟包埋并連續(xù)切片后,用常規(guī)H&E(hematoxylin-eosinstaining)病理染色法系統性地觀察家蠶幼蟲及變態(tài)發(fā)育階段的中腸組織結構變化。統計分析各齡期內盛食期、眠前和眠期三個時間點的中腸橫切面大小變化的結果表明,幼蟲1、2、3、4齡期內的中腸橫切面大小呈逐

4、漸增加的趨勢,并且眠前和眠期中腸的橫切面顯著高于盛食期(p＜0.05),同時發(fā)現位于基底膜處的小細胞在每次經歷蛻皮之前會明顯增多。5齡家蠶的中腸組織的結構變化與之前齡期有所不同,起蠶至4天整個中腸組織橫切面顯著增大(p＜0.001),進入5齡末期的中腸發(fā)生明顯皺縮,橫切面顯著減小(p＜0.001)。
　　 進入變態(tài)發(fā)育時期中腸的形態(tài)結構由幼蟲時期長圓筒狀逐漸萎縮變成略顯扁平的橢圓形,幼蟲的中腸組織開始出現大規(guī)模退化,并形成黃體(

5、yellowbody,YB)排入腸腔,同時形成新的蛹.成蟲中腸上皮層組織。
　　 利用DAPI染色技術統計分析1、2齡期各時間點內中腸細胞總數和三種類型細胞數目的變化情況,結果顯示各種類型中腸細胞總數及各種類型的細胞數隨著蠶體的生長發(fā)育呈顯著增加的趨勢(p＜0.05),其中眠前和眠期階段位于基底膜的小細胞在中腸細胞總數中的百分比顯著高于其他時間點(p＜0.05)。
　　 2,分子標記利用BrdU和PHH3標記中腸內發(fā)生增

6、殖的細胞
　　 本實驗將家蠶中腸經常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片后,通過BrdU和PHH3兩種抗體的免疫熒光雙重標記,找到家蠶中腸上皮層中發(fā)生增殖的細胞,并對不同齡期所發(fā)生的增殖細胞數目進行統計分析。結果表明家蠶在眠前階段的BrdU和PHH3標記陽性率都顯著高于盛食期(p＜0.05),家蠶中腸內一些大細胞和小細胞能被BrdU不同程度的標記,而有絲分裂的常用檢測物PHH3僅能標記位于上皮細胞層基底膜的小細胞。幼蟲和蛹期中腸上皮細胞的BrdU

7、陽性標記率呈顯著性差異(p=0.027),蛹期中腸的生命活動和上皮細胞更新速度都比幼蟲時期緩慢得多。
　　 3,BrdU滯留標記
　　 本實驗采用經典的BrdU滯留標記實驗(BrdUlabelretention)初步識別家蠶中腸內可能存在的干性細胞。通過對四齡家蠶三次間歇性注射BrdU(15ug),利用其標記滯留細胞的方法,研究家蠶中腸上皮細胞層中可能存在的干性細胞數量、形態(tài)及分布特點。統計分析BrdU滯留標記陽性率的不