植酸酶appA基因的克隆、表達及酶學性質分析.pdf

1、植酸是植物性飼料中磷的主要存在形式，在谷物和豆類中其含量超過總磷的80％，磷是動植物生長發(fā)育不可缺少的重要元素之一。植酸酶是一種能夠水解植酸并釋放無機磷的磷酸酶類，廣泛存在于植物及微生物中，它作為單胃動物的飼料添加劑已得到了世界范圍內的廣泛認可。單胃動物的胃、腸道環(huán)境中因缺乏植酸酶或植酸酶活性很低導致不能分解植酸而釋放其中的無機磷，植酸能夠螯合植物營養(yǎng)因子降低其利用率，導致必須向飼料中添加營養(yǎng)因子以滿足其生長發(fā)育的需要，從而造成成本增高

2、和帶來環(huán)境污染等影響。通過向動物飼料中添加植酸酶就可以緩解這一問題。
　　 來自于大腸桿菌的appA植酸酶是一種新型的植酸酶，它在單胃動物胃腸道的酸性環(huán)境中適應能力和分解植酸的能力都很強，而且，appA植酸酶還是目前已知的活性最強的植酸酶。
　　 本研究采用維生素C-鉬藍法從飼喂青飼料的豬糞便中篩選到一株高產(chǎn)appA植酸酶活性的大腸桿菌菌株，并根據(jù)已報道的基因序列設計一對特征性PCR引物，克隆到了該植酸酶appA基因。D

3、NA測序結果表明，本研究所克隆到的植酸酶基因片段與已報道的appA植酸酶基因具有較高的同源性，該植酸酶appA基因閱讀框大小為1233 bp，編碼411個氨基酸，其表達產(chǎn)物理論分子質量(MW)和等電點(pI)分別為44.821 kDa和6.09，(G+C)％含量為54.60％。氨基酸結構分析表明該appA植酸酶具有與酸性磷酸酶相同的活性保守基序RHGxRxP和催化活性中心HD，并且存在有3個潛在N-糖基化位點。
　　 為獲得大量

4、的appA植酸酶，我們將appA基因克隆到甲醇營養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母GS115中進行誘導表達，經(jīng)PCR陽性鑒定和酶活性測定，篩選到了一株能夠表達較高酶活性的appA植酸酶基因工程菌GS115/appA，通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測表達產(chǎn)物，得到一條約55～60 kDa的特征條帶。表達蛋白經(jīng)Ni親和柱純化，其appA植酸酶比活力為2669.46U/mg，分子量約57.2 kDa。酶學性質分析表明，重組appA植酸酶的最適溫度和最適pH分