利用噬菌體展示技術(shù)篩選Cry2Ab毒素受體結(jié)合表位的研究.pdf

1、利用蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)殺蟲(chóng)基因發(fā)展的Bt作物已經(jīng)成為防治多種害蟲(chóng)的新手段。轉(zhuǎn)Bt-Cry1Ae抗蟲(chóng)棉花在我國(guó)通過(guò)有效控制棉鈴蟲(chóng)的危害,可降低植棉成本和提高棉花的產(chǎn)量,但隨著B(niǎo)t-Cry1Ac棉花的大面積推廣,棉鈴蟲(chóng)的抗性風(fēng)險(xiǎn)不斷上升,嚴(yán)重威脅Bt棉花的持續(xù)利用。Cry2Ab毒素是新一代Bt棉花的主要?dú)⑾x(chóng)成分,已有研究證明棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry2Ab與Cry1Ac毒素沒(méi)有交互抗性,因此可通過(guò)種植新

2、一代Bt棉花治理對(duì)Cry1Ac棉花的抗性。但到目前為止,國(guó)內(nèi)外對(duì)Cry2Ab在棉鈴蟲(chóng)中腸內(nèi)的受體結(jié)合蛋白種類和受體結(jié)合表位等尚不清楚。鑒于Cry2Ab毒素與昆蟲(chóng)中腸受體的結(jié)合是發(fā)揮作用的關(guān)鍵步驟,尋找棉鈴蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞上的毒素結(jié)合蛋白和結(jié)合位點(diǎn),對(duì)闡明Cry2Ab毒素作用機(jī)理,發(fā)展棉鈴蟲(chóng)抗性治理技術(shù)有重要意義。本文應(yīng)用噬菌體展示技術(shù),對(duì)Cry2Ab毒素模擬表位進(jìn)行了體外篩選,并驗(yàn)證了模擬肽序列的生物學(xué)功能。
　　 Cry2Ab毒

3、素在活化并純化后,經(jīng)“吸附-洗脫-擴(kuò)繁”的4輪生物淘選,并對(duì)陽(yáng)性克隆所攜帶的外源DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定后,得到與活化Cry2Ab毒素具有高親和力的模擬肽序列NQFPSGAVYEHS和ATNEFPNPLHAP。將這兩段多肽與Cry2Ab毒素進(jìn)行ELISA結(jié)合分析表明它們能與活化的Cry2Ab毒素進(jìn)行特異性結(jié)合.通過(guò)Westearn-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),加入的兩段多肽序列,可以抑制活化Cry2Ab與棉鈴蟲(chóng)中腸BBMV的結(jié)合。將兩段模擬肽分別與

4、毒素孵育后,飼喂初孵棉鈴蟲(chóng)可顯著降低Cry2Ab毒素對(duì)棉鈴蟲(chóng)的致死和生長(zhǎng)抑制作用。對(duì)活化Cry2Ab的Ligand-blot分析發(fā)現(xiàn),毒素在棉鈴蟲(chóng)中腸BBMV上存在42kDa和100kDa兩個(gè)結(jié)合蛋白。
　　 上述實(shí)驗(yàn)表明,篩選到的模擬肽序列具有明顯的生物學(xué)功能,其可能與Cry2Ab毒素在棉鈴蟲(chóng)中腸內(nèi)的受體結(jié)合位點(diǎn)具有相似的氨基酸序列或空間結(jié)構(gòu)。Ligand-blot實(shí)驗(yàn)證明Cry2Ab毒素主要存在兩種受體蛋白,其作用的發(fā)揮可能