RNAi調控玉米抗甘蔗花葉病毒和粗縮病毒的研究.pdf

1、玉米是重要的糧食、飼料與工業(yè)原料作物。目前我國玉米的種植面積呈逐年增加的趨勢，但玉米病害尤其是玉米的矮花葉病和粗縮病成了限制我國玉米生產發(fā)展的巨大障礙，造成玉米的大量減產和品質下降。利用基因工程技術培育推廣抗病品種和尋找新方法已成為病毒病防治的迫切需求。RNA干涉作為一種特異、高效的反向遺傳學手段，在植物的抗病毒育種中表現出了巨大的優(yōu)勢，成為植物抗病毒基因工程的熱點。為進～步篩選和建立病毒cp基因dsRNA的原核表達體系和遺傳轉化體系，

2、探討RNAi技術在玉米抗病毒基因工程中的應用效果，建立玉米RNAi的分子育種新方法。本文利用大腸桿菌HT115高效表達甘蔗花葉病毒cp基因dsRNA，較系統地研究了外源dsRNA抗甘蔗花葉病毒RNAi調控技術；構建了兼抗甘蔗花葉病毒及粗縮病毒cp基因的RNAi復合表達載體，開展農桿菌介導的玉米原位轉化，并對轉化株進行了分子確證，在此基礎上對轉化株RaNAi效果和抗病性進行了分析，獲得了如下主要結果：
　　 l、根據甘蔗花葉病毒c

3、p基因序列設計特異性引物，RT-PCR擴增甘蔗花葉病毒cp基因特異性干涉片段，構建cp基因反向重復原核表達載體LMCP。利用IPTG進行誘導表達并對誘導表達條件進行優(yōu)化。結果表明，經過IPTG誘導，LMCP在大腸桿菌HT115(DE3)菌株中可表達產生預期大小的片段，經DNaseⅠ和RNase A消化處理，證實為dsRNA。同時IPTG濃度為0.4～0.6mmol/L，誘導表達4 h，dsRNA的表達量最高。
　　 2、利用大腸

4、桿菌表達的dsRNA提取液處理玉米8112植株，并對處理參數進行了優(yōu)化，結果表明當dsRNA稀釋1/5濃度以下時處理效果明顯；dsRNA噴灑后3 d內接種病毒，抗病毒侵染效果最好；另外，加入適宜濃度的滲透劑能提高dsRNA的抗病效果。
　　 3、RT-PCR分別擴增甘蔗花葉病毒和粗縮病毒外殼蛋白基因特異性RNA干擾片段，分別構建成反向重復序列并串聯在一起，再與抗除草劑bar基因分別插入到pDTBU的兩個T-DNA區(qū)段，構建了兼抗

5、甘蔗花葉病毒和粗縮病毒的RNA干涉復合表達載體pDTBU SM。并通過凍融法將該載體直接導入農桿菌，獲得了經PCR鑒定的轉化子，用于農桿菌介導的玉米原位轉化。
　　 4、利用農桿菌介導的原位轉化技術將cp基因RNA干涉表達載體pDTBU SM轉入玉米8112自交系，對T0代植株進行除草劑Basta篩選，結合PCR擴增篩選得到19株共轉化植株，對T1代共轉化株系進行PCR檢測及Southern雜交分析，證明有3個株系發(fā)生了分離，且

6、獲得了整合有cp基因。RNAi片段的轉化株。
　　 5、提取T1代不同轉化株的葉片總RNA以及開花期不同器官的RNA，經反轉錄反應后，進行熒光定量檢測cp基因在不同轉基因植株以及在同一轉基因植株不同器官中的表達量，結果表明轉化的cp基因干涉片段在不同轉基因植株中的表達量不同。目的基因在雄花和葉中的表達量最高，而在根中的表達量最低。
　　 6、T2代轉基因玉米植株4葉期時接種甘蔗花葉病毒，并于接毒后不同時間提取葉片總RNA

7、，熒光定量檢測外源病毒誘導對內源cp基因表達的影響，結果表明轉化的cp基因干涉片段對甘蔗花葉病毒產生了干涉效應，轉入的cp基因RNAi片段在轉基因植株中能正確轉錄，并導致cp基因mRNA含量的交替變化。
　　 7、對T2代4葉期轉基因玉米接種甘蔗花葉病毒，于接毒后14 d、21 d、30 d取葉片，ELISA檢測植株的發(fā)病情況，結果表明，不同轉化株株系的感病情況有差異，但抗病性均不同程度地高于對照。
　　 綜上所述，本文