綿羊MHC 222G18 BAC克隆基因篩選和綿羊MHC已知基因的克隆與原核表達.pdf

1、目的：綿羊主要組織相容性復合體（MHC）是與綿羊各種抗原遞呈、免疫調節(jié)、抗性/易感性等緊密相關的基因簇，這些基因是一組緊密連鎖的基因群。目前我們對綿羊MHC的基因組結構信息知之甚少。開展綿羊基因組MHC區(qū)段基因結構與組成的研究旨在尋找并研究與重要經濟性狀緊密相關的基因以及與綿羊對疾病的抗性或易感性相關的基因，并用于指導遺傳育種。本研究的目標是利用本實驗室構建的中國美利奴綿羊細菌人工染色體（BAC）文庫和高密度物理圖譜，篩選出中國美利奴細

2、毛羊MHCclassII區(qū)222G18BAC克隆內的表達基因，分析綿羊222G18 BAC克隆的基因結構。同時，對綿羊MHC區(qū)段已知基因進行克隆與原核表達，為相應基因功能的研究奠定基礎。
　　方法：對MHC區(qū)段陽性克隆222G18，用BsaJⅠ酶切后制備α-32P放射性探針，通過噬菌斑原位雜交技術篩選中國美利奴綿羊五種組織cDNA混合文庫，篩選出該BAC克隆插入片段中可表達基因。同時，利用GenBank數據庫中已有的綿羊、牛MHC

3、基因的EST序列以及雜交篩選獲得的序列，進行序列分析。對部分MHC全序列基因設計特異性引物，PCR克隆并進行原核表達，并對表達出的蛋白質進行初步分析。
　　結果：經過兩輪雜交篩選，獲得12個cDNA陽性克隆，經測序、比對等生物信息學分析確定獲得7條與免疫相關的序列，其中3條具有完整的編碼序列。利用SIM4軟件將7條序列定位到BAC克隆上，結果顯示綿羊MHC區(qū)段的表達序列多為斷裂基因且跨度很大。同時，對綿羊MHC的MHCI、DRA、

4、DRB1、DQB1、DQA1和DQA2這6個已知基因進行了特異PCR克隆。對DQA1和DRB1進行原核表達，表達的蛋白質大小分別為28KDa和30KDa。
　　結論：綿羊MHC區(qū)段BAC陽性克隆222G18的雜交篩選共得到7個基因，其中3個具有完整編碼序列，分別編碼綿羊MHC區(qū)段DRA、DRB1和BTNL2基因的完整序列?；駾RA與綿羊細菌性腐蹄病相關，基因DRB1與綿羊胃腸道線蟲病和淋巴瘤相關，基因BTNL2與結節(jié)病和包涵體皮