過表達小麥泛素基因Ta-Ub2加快煙草發(fā)育進程機制的研究.pdf

1、蛋白質作為生物體細胞的組成成分以及生命活動的主要承擔者，其合成和降解對生物體具有十分重要的意義。蛋白質降解主要通過兩種途徑：溶酶體降解以及需能的泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-26S Proteasome System，UPS)。UPS在泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素連接酶(E3)的共同作用下，將76個氨基酸組成的標簽蛋白泛素(Ubiquitin，Ub)結合到底物蛋白上。標記后的蛋白被蛋白酶體降解或者進行信號

2、通路的調節(jié)。通過對底物蛋白進行不同形式的泛素化修飾，可以調節(jié)多種細胞活動，如信號轉導、基因轉錄以及細胞程序性死亡等。
　　 近年來的研究表明，UPS參與調節(jié)幾乎所有的植物生長發(fā)育過程，但是以前的研究主要集中在E3的作用上，對泛素在這些過程中的作用，報道較少。實驗室之前獲得了過表達小麥泛素基因Tα-Ub2的轉基因煙草，初步觀察發(fā)現(xiàn)，轉基因植株的表型變化較大，但是過量表達Tα-Ub2引起轉基因植株表型變化的機制不清楚。本研究首先通過

3、基因組PCR和半定量RT-PCR的方法鑒定了T-2、T-11兩個株系用做實驗材料，研究泛素對植物生長發(fā)育的作用，及其生理與分子機制。主要研究結果如下：
　　 (1)表型觀察與結果統(tǒng)計顯示，過量表達Tα-Ub2的轉基因煙草T-2和T-11相對于野生型煙草表現(xiàn)出明顯的生長加快，開花提前。轉基因煙草的花期相對野生型煙草提前約30天。
　　 (2)為進一步明確煙草的發(fā)育狀況，用實時定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測煙草的發(fā)育

4、標記基因(NtMADS-4、NtMADS-11)的表達，以在分子水平上確定轉基因和野生型煙草發(fā)育時期的差異。結果顯示轉基因煙草NtMADS-11的表達量與遲后30天的野生型煙草相似，進一步在分子水平上說明過表達Tα-Ub2加快了煙草的發(fā)育進程。
　　 (3)用蛋白免疫方法檢測了開花期的野生型煙草泛素蛋白的含量變化，結果表明，伴隨著煙草頂端發(fā)育過程，頂端組織泛素水平變化明顯，暗示泛素參與煙草頂端發(fā)育過程。
　　 (4)提前

5、抽薹是轉基因煙草最顯著的性狀，同時可能是生長加快、提前開花的原因，而GA在植物抽薹過程中具有重要作用。我們用高效液相色譜的方法測定了轉基因煙草葉片和莖尖的總赤霉素(GA)的含量，結果顯示轉基因煙草的總GA含量均高于野生型或與野生型煙草持平?？紤]到總GA包括GA前體、活性GA以及無活性的GA，進一步地用酶聯(lián)免疫法測定了活性GA含量，結果顯示轉基因煙草葉片和莖尖的GA3和GA4水平均高于野生型。
　　 (5)外源施加GA3使野生型煙

6、草的抽薹提前，并且使野生型煙草表現(xiàn)為類似轉基因煙草的表型。進一步說明轉基因煙草體內的GA的含量增加可能是造成了抽薹提前的原因。
　　 (6)GA的生物合成與代謝是一個復雜的過程，其中許多關鍵酶在GA代謝以及活性GA水平控制中具有重要作用，包括GA20氧化酶、GA3氧化酶以及GA2氧化酶。我們用qRT-PCR的方法在煙草發(fā)育過程中幾個關鍵時間點，檢測了GA20氧化酶、GA3氧化酶以及GA2氧化酶的表達水平，結果顯示過表達Tα-Ub