油菜(Brassica napus)miRNA的鑒定及Bna-miR1140表達調控機制研究.pdf

1、miRNAs(microRNA)是一類在進化上保守的長約21nt的非編碼單鏈RNA,在基因表達調控的網絡中處于核心位置,高效的調控其靶基因的翻譯或表達,在生物體生長發(fā)育、抵抗生物或者非生物脅迫以及在生物體代謝途徑中起著非常重要的作用。在短短的10年時間內,植物miRNAs的研究取得了突飛猛進的成果,成為一個新的研究領域。油菜(rapeorrapeseed)作為世界性的重要油料作物,研究其miRNA所參與的遺傳控制機理,對于培育理想油菜品

2、種,增加油菜產量和降低油菜生產成本具有重要意義。
　　鑒于目前對油菜miRNAs及其靶基因的研究報道還很少,且sanger數(shù)據庫中可參考的miRNAs信息也僅僅48條,本研究對甘藍型油菜(Brassicanapus)栽培種Westar材料進行小RNA測序及降解組分析,鑒定新的油菜miRNAs,尋找已知miRNAs和新發(fā)現(xiàn)的miRNAs的靶基因,并對蕓薹屬獨特的miRNA家族Bna-miR1140進行表達調控機制研究,以期為油菜品種

3、改良和油菜miRNAs調控機制的研究提供理論依據。
　　主要結果如下:
　　1.鑒定獲得了41個新的保守油菜miRNAs以及67個蕓薹屬特有的新候選miRNAs,其中包括20個miRNAs*序列。利用實時熒光定量RT-PCR技術驗證了測序結果。并將新發(fā)現(xiàn)的miRNAs提交miRBase數(shù)據庫。
　　2.依據NCBI中現(xiàn)有的油菜EST和基因組數(shù)據,利用targetfinder軟件預測了油菜miRNAs靶基因,分別獲得保守

4、的miRNAs和特異的新候選miRNAs靶向的基因113個和84個。其中Bna-miR1140的潛在靶基因為一種糖基轉移酶(glycosyltransferase)和響應調節(jié)因子(ArabidopsisresponseregulatorARR8-likeprotein)。
　　3.克隆得到了油菜Bna-miR1140基因前體197bp的片段,構建了植物過表達載體35S::Bna-miR1140,通過農桿菌介導法浸染油菜子葉柄轉化甘

5、藍型油菜栽培種Westar。獲得了14個PCR陽性植株,其中有5株株型特異,表現(xiàn)雙主序表型,分枝數(shù)明顯增多,其他9株陽性株均與野生型油菜表型一致,推測可能與表達強度有關。調查了株型特異的5個株系T1代表型分離情況,經卡方檢驗發(fā)現(xiàn)其中有4個株系的株型變異遺傳符合3:1的孟德爾分離規(guī)律。初步推測油菜Bna-miR1140可能參與調控了油菜的分枝發(fā)育。
　　4.分離得到了油菜Bna-miR1140基因上游1351bp的序列,利用plan

6、tCARE在線軟件對啟動子序列的順式作用元件進行在線分析,該啟動子含有與轉錄必需的RNA聚合酶結合的TATA盒以及在調控基因轉錄效率中發(fā)揮重要作用的CAAT盒,并進一步構建了miR1140pro::GUS植物表達載體。通過農桿菌介導法轉化油菜,得到5株PCR陽性植株,對轉基因植株的根、莖、葉、葉腋(莖尖分生組織,SAM)、葉柄、花、種莢等組織和器官進行GUS染色分析,結果表明GUS僅在葉柄及葉腋中表達,這與Bna-miR1140體內表達