半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞系建立研究.pdf

1、魚類細(xì)胞培養(yǎng)的研究始于20世紀(jì)60年代。1962年，Wolf和Quimby建立了世界上第一個(gè)魚類細(xì)胞系，即虹鱒魚生殖腺細(xì)胞系RTG-2。此后，魚類細(xì)胞系的建立及其相關(guān)研究進(jìn)展迅速。迄今為止，不僅建立了280余株魚類細(xì)胞系，而且魚類培養(yǎng)細(xì)胞已成為一種重要的研究手段在病毒學(xué)、免疫學(xué)、魚類資源保護(hù)與遺傳育種、腫瘤學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、魚類生理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)等方面的理論及應(yīng)用研究中發(fā)揮作用。因此，對(duì)魚類細(xì)胞培養(yǎng)及其細(xì)胞系建立進(jìn)行研究具有深遠(yuǎn)意義。

2、>　　 半滑舌鰨經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，自然資源量少，是我國(guó)新開發(fā)的重要海水養(yǎng)殖魚類。然而，近年來，隨著日益加劇的環(huán)境污染、養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以及集約化程度的提高，半滑舌鰨病害導(dǎo)致的死亡事件時(shí)有發(fā)生，給半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。半滑舌鰨致病病原特性和免疫抗病基因功能的研究是從根本上解決病害的方法；同時(shí)，半滑舌鰨雌、雄個(gè)體差異非常大，并且屬ZW型性別決定體系，是開展性別分化研究的理想材料。細(xì)胞系作為一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)，因其成本低、試驗(yàn)重復(fù)性好、

3、條件可精確控制的優(yōu)點(diǎn)而成為該魚種相關(guān)研究的重要工具。
　　 本論文選取雌性半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)頭腎、心臟、卵巢組織開展了細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞系建立研究。半滑舌鰨頭腎細(xì)胞系(TSHKC)、心臟細(xì)胞系(TSHC)和卵巢細(xì)胞系(TSOC)的培養(yǎng)基為添加20％FBS，50mM2-Me，100 U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，1m M丙酮酸鈉，10 ng/ml bFGF的MEM完全培養(yǎng)基，三種細(xì)胞的形

4、態(tài)均為成纖維樣。TSHKC、TSHC、TSOC細(xì)胞至今分別已傳代40余代，30余代，30代。實(shí)驗(yàn)中開展了溫度對(duì)TSHKC細(xì)胞生長(zhǎng)影響分析，結(jié)果表明TSHKC細(xì)胞能在15-30℃溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，細(xì)胞系的原代培養(yǎng)溫度是該細(xì)胞系最適宜的生長(zhǎng)溫度，較高或較低的溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用，其中較高溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響最明顯。TSHKC、TSHC和TSOC的二倍體核型均為2n=42，且具有異型W染色體。用牙鲆淋巴囊腫(LCDV)分別感染細(xì)胞系TSH

5、KC、TSHC和TSOC細(xì)胞，觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，透射電鏡下分別在TSHKC、TSHC和TSOC細(xì)胞內(nèi)觀察到病毒顆粒。將GFP和GRP報(bào)告基因通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入TSHKC細(xì)胞中并成功獲得了表達(dá)；將GFP報(bào)告基因通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)入TSHC和TSOC細(xì)胞中也成功獲得了表達(dá)。
　　 文中對(duì)雌性半滑舌鰨脾臟、肝臟組織的細(xì)胞離體培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究，描述了脾臟組織中淋巴細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，對(duì)肝

6、臟細(xì)胞的離體培養(yǎng)進(jìn)行了初步探索，為脾臟免疫細(xì)胞功能研究奠定基礎(chǔ)的同時(shí)，為今后脾臟、肝臟細(xì)胞系的建立提供了依據(jù)。其次，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將GRP和GFP報(bào)告基因分別在脾臟和肝臟的細(xì)胞中得到表達(dá)，為利用脾臟、肝臟細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)染及功能研究提供了依據(jù)。
　　 綜上所述，文中通過不同的魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，建立了雌性半滑舌鰨頭腎細(xì)胞系、心臟細(xì)胞系和卵巢細(xì)胞系，并從病毒感染性和外源基因轉(zhuǎn)染性兩個(gè)方面對(duì)細(xì)胞系的應(yīng)用性進(jìn)行研究，為今后在