金花茶離體再生體系的優(yōu)化及分子機制研究.pdf

1、本研究以金花茶（Camellia nitidissima Chi.）為材料，在本實驗室以往的研究基礎上，進行如下研究：①金花茶離體再生體系優(yōu)化，包括花藥胚性愈傷組織誘導的優(yōu)化、金花茶體胚成熟的調控與萌發(fā)研究；②金花茶體胚Cn-SERK基因cDNA和DNA克?。虎劢鸹ú梵w胚Cn-SERK基因啟動子克??；④金花茶Cn-SERK基因啟動子5′端不同缺失突變體載體構建，并轉化煙草進行其功能驗證，為探討金花茶體胚發(fā)育中的Cn-SERK作用機制提供

2、參考。主要研究結果如下：
　　1、金花茶離體再生體系的優(yōu)化
　　1.1金花茶花藥胚性愈傷組織誘導的優(yōu)化
　　以金花茶花藥為材料，誘導其分化愈傷組織，結果表明：在4號培養(yǎng)基：2 mg/L2,4-D+0.5 mg/L KT+1 mg/L NAA+50 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上的花藥愈傷組織誘導率最高達到67.10%。誘導出的白色愈傷可以在分化培養(yǎng)中變綠，根據以往的研究經驗，可以斷定其為胚性愈傷組織。
　　

3、1.2金花茶體胚成熟的調控與萌發(fā)
　　該試驗研究了不同濃度的ABA，不同濃度的ABA、肌醇、瓊脂、蔗糖組合，不同的光質對體胚成熟的作用，在進行成熟培養(yǎng)之后，轉入成苗培養(yǎng)基中以體胚變紅為指示。結果表明：在經過ABA的單因素處理后，ABA在濃度為5.0 mg/L時，處理的效果最好。在不同濃度的ABA、肌醇、瓊脂、蔗糖組合的培養(yǎng)基中，誘導體胚成熟的最佳組合為：10 mg/L ABA+100 mg/L肌醇+50 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂

4、。將體胚在紅光、藍光、綠光、白光培養(yǎng)之后，轉入成苗培養(yǎng)基中生長，發(fā)現只有在白光下誘導成熟的體胚才能變紅，在其他的單質光中培養(yǎng)的體胚只有極少數變紅。在經過成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)60d之后，紅色的體胚慢慢的變?yōu)榫G色或者墨綠色，在這些體胚上開始分化產生一些微小葉芽，莖或者是長有根毛的不定根，最后葉芽伸長形成小植株。
　　2、金花茶體胚Cn-SERK基因的cDNA全長克隆及生物信息學分析
　　以金花茶體胚為材料，采用RT-PCR以及RACE

5、方法，獲得了金花茶體胚Cn-SERK基因的cDNA全長序列，GenBank登錄號為：JX123756.1。該基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，其中5′UTR長度為47bp、ORF為1875bp、3′UTR為197bp、poly(A)尾巴為28bp，開放閱讀框編碼624個氨基酸，將其命名為Cn-SERK。應用生物信息學的方法分析表明：該蛋白質具有蛋白質 N端富亮氨酸重復結構的超級家族結構域，親水、且具有信號肽的跨膜蛋白，裂解成

6、熟位點可能存在于25-26個氨基酸之間，跨膜結構域有5個，定位于內質網的可能性最高，達到0.685。蛋白的二級結構無卷曲螺旋結構，主要有α螺旋和無規(guī)則卷曲構成，存在一個蛋白激酶位點。此蛋白可能發(fā)生絲氨酸磷酸化位點的有16個，酪氨酸和蘇氨酸磷酸化位點各5個。
　　3、金花茶體胚Cn-SERK基因DNA序列的克隆
　　以金花茶體胚DNA為模板，克隆得到了金花茶體胚Cn-SERK基因DNA序列，ATG和TGA分別為起始密碼子和終止

7、密碼子，該基因ORF的DNA序列全長為8593bp。內含子分析表明Cn-SERK基因由11個外顯子和10個內含子組成，且每個內含子的剪切位點符合GT-AG規(guī)則。使用PlantCARE軟件分析內含子序列，發(fā)現在內含子中含有類似啟動子中的順式元件，且都具有核心啟動子元件CAAT-Box。內含子中的調控元件可能對基因的特異性表達有調控作用，可能影響轉錄的起始和延伸并且可能具備較強的啟動子功能，在小麥、茶樹、老鼠、人等生物上也有類似報道。

8、>　　4、金花茶體胚Cn-SERK基因啟動子的克隆
　　采用連接介導染色體步移法克隆金花茶體胚Cn-SERK基因啟動子，得到Cn-SERK基因啟動子的長度為596bp，在線預測位置336-386處為基礎啟動子區(qū)域，可信度達0.97，序列為：5′-AAGCAAAGCATAAAAAAGTTGCAGAGCAGATACAACAACAACCGATTAGG-3′，轉錄起始位點預測在377bp處的A。用PlantCARE軟件發(fā)現了該序列的一些元

9、件，其中有核心啟動子元件TATA-Box(22處)和CAAT-Box(10處)，該序列基本可以推斷認定為其含有基礎啟動子區(qū)域。與高轉錄水平相關的5′UTR Py-rich stretch（3處），與厭氧反應有關的順式作用元件ARE（1處），部分光響應元件AT1-motif（1處），部分包含光響應的保守DNA元件ATCC-motif（1處），真菌誘導響應元件Box-W1（1處），MYB結合位點MBS（1處），光響應元件Sp1（1處），部分

10、光響應元件I-box（1處）、TCCC-motif（1處），生長素響應元件TGA-element（1處），未知功能元件3個（5處）。
　　5、金花茶Cn-SERK基因啟動子5′端不同缺失突變體載體構建與功能驗證
　　試驗采用金花茶Cn-SERK基因5′端缺失突變啟動子取代pCAMBI1301上的CaMV35S啟動子，與GUS報告基因融合，構建含GUS基因的植物表達載體，檢測其在煙草植株中的表達情況，分析影響啟動子表達的因素，

11、最終確定啟動子中缺失片段的功能。以克隆得到的啟動子片段為模板，選用XbaⅠ和 NcoⅠ為缺失片段上下游的酶切位點，擴增目的缺失片段。使用pCAMBI1301質粒為載體，通過對質粒的雙酶切、缺失片段與質粒的連接，構建Cn-SERK基因啟動子5′端不同缺失突變體的載體，并對重組質粒進行檢測，證實缺失片段已與質粒連接。將驗證后的重組質粒轉化到農桿菌LBA4404中，進行PCR檢測，以帶有目片段的農桿菌制作侵染煙草的菌液。將煙草切成0.5 cm