利用RNA-Seq技術(shù)分析水稻稻瘟病持久抗性基因pi21的抗病機(jī)制.pdf

1、水稻（Oryza sativa）是世界上重要的糧食作物之一，而水稻稻瘟病等病害嚴(yán)重地制約著水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。培育稻瘟病抗性品種尤其是持久抗性品種已成為治理水稻稻瘟病的主要方法之一。水稻稻瘟病持久抗性基因pi21在許多粳稻品種中存在，因此可以在世界范圍內(nèi)廣泛使用，以提高水稻的稻瘟病抗性。本研究以受稻瘟病菌接種誘導(dǎo)的Pi21-RNAi轉(zhuǎn)基因系和日本晴為材料，利用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)對(duì)水稻與稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的互作

2、進(jìn)行研究，獲得如下研究成果:
　　1.本研究用兩種稻瘟病菌生理小種（TMC-1和GUY11）分別接種Pi21基因RNAi表達(dá)轉(zhuǎn)基因系241材料（抗?。┖腿毡厩纾ǜ胁?duì)照材料），并在接種后五個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24 h、48 h、72 h)分別取樣（葉片組織），共獲得20份受稻瘟病菌誘導(dǎo)的材料。半定量RT-PCR分析病程相關(guān)基因（WRKY，ABC，Kinase，MYB，pathogen-related gene等五類基因）在接種

3、材料中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)抗感材料之間存在基因表達(dá)差異，并且材料在兩種稻瘟菌誘導(dǎo)后表現(xiàn)出相似的表達(dá)量變化，說(shuō)明稻瘟病菌接種實(shí)驗(yàn)效果較好，創(chuàng)制的材料能夠反映pi21與稻瘟病菌之間的互作關(guān)系。
　　2.采用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)20個(gè)受稻瘟病菌誘導(dǎo)的水稻材料進(jìn)行測(cè)序，共獲得約217M的Clean Reads，占Raw Reads的比例高達(dá)97.41％。每個(gè)樣品的Clean Reads數(shù)都在10M以上，測(cè)得的堿基數(shù)在500Mb以上。利

4、用SOAP短序列比對(duì)軟件將Clean Reads比對(duì)到水稻粳稻品種日本晴基因組序列上（允許兩個(gè)堿基錯(cuò)配），結(jié)果顯示，17個(gè)樣品的比對(duì)比例在86.97％以上，另外3個(gè)樣品TMC-Nip-72h(75.85％)、GUY-Nip-72h(68.54％)、TMC-241-72h(75.19％)的比對(duì)比例相對(duì)較低。將Clean Reads比對(duì)到日本晴基因序列上時(shí)，也獲得一致的比對(duì)結(jié)果。測(cè)序飽和度分析顯示，當(dāng)Clean Reads數(shù)大于10 M時(shí)，

5、測(cè)序深度已達(dá)到飽和。序列在基因的5'-3'方向分布大致均勻，說(shuō)明樣品mRNA打斷隨機(jī)性好。這些指標(biāo)均說(shuō)明測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量比較高。
　　3.利用RPKM法計(jì)算每個(gè)樣品中43222個(gè)水稻基因的基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品全部基因的RPKM平均值介于15.2～16.9之間，說(shuō)明20個(gè)樣品mRNA轉(zhuǎn)錄的總水平一致。在|log2Ratio|≥1且FDR≤0.001的條件下，對(duì)兩兩樣品之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選。這些差異基因?yàn)橄乱徊胶Y選與pi21抗