副豬嗜血桿菌重要免疫原性相關蛋白發(fā)掘及GAPDH免疫調節(jié)機理研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌能夠引起豬的多發(fā)性漿膜炎，關節(jié)炎和腦膜炎，已成為引起豬細菌性疾病最重要病原之一。仔豬感染副豬嗜血桿菌之后幾天就可以發(fā)病，并經常引起死亡。從急性期發(fā)病康復的仔豬經常會出現慢性關節(jié)炎癥狀?？股刂委煾必i嗜血桿菌有一定效果。但長期使用一方面導致細菌耐藥情況嚴重，另一方面抗生素的濫用導致藥物在動物食品的藥物殘留。因此，疫苗仍然是控制該病原菌最佳的手段。到目前為止，副豬嗜血桿菌共鑒定出15種血清型，每種血清型菌株的毒力又有差異。此外，

2、還有很多菌株沒有被定型。各種血清型之間的交叉免疫保護十分有限。當前使用的商業(yè)化滅活疫苗能夠對同源血清型菌株感染提供一定的免疫保護，但不能提供異源血清型菌株感染的交叉保護。因此，急需研制開發(fā)出一種能夠提供持久免疫保護和針對多種血清型菌株感染具有交叉免疫保護的新型疫苗。目前，關于副豬嗜血桿菌毒力相關因子很少被報道。外膜蛋白是細菌的表面重要組成部分，能夠和宿主細胞發(fā)生互作，并誘導宿主產生保護性抗體和引起細胞免疫反應。因此針對靶向外膜蛋白發(fā)展疫

3、苗非常有價值。本課題在實驗室前期完成的副豬嗜血桿菌流行優(yōu)勢血清5型SH0165菌株全基因組序列基礎上，基于生物信息學及SignalP2.0軟件，預測了副豬嗜血桿菌可能的重要外膜蛋白。進一步將編碼外膜蛋白基因克隆、表達純化后利用動物感染模型進行了蛋白免疫原性研究。同時，開展了外膜蛋白的免疫生物學活性研究，并從中篩選到了一個能夠促進B細胞和T細胞增值的蛋白3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，可能是一個重要免疫調節(jié)蛋白，深入探討了該免疫調節(jié)蛋

4、白免疫調節(jié)的機理。構建了編碼GAPDH蛋白的DNA疫苗，并開展了相關免疫原性及免疫保護研究。主要的研究內容包括如下：
　　 ⑴副豬嗜血桿菌SH0165菌株可能外膜蛋白預測、蛋白免疫原性和保護效力研究。首先利用SignalP2.0軟件，通過同源相似性比對預測了cdtB，GAPDH，HPS-2037, OmpP1, HPS-0220, HPS-0675,HPS-1406, HPS-1834, OapA, IdgA等10個可能的外膜蛋

5、白，克隆表達并純化了10個外膜蛋白。將10種重組外膜蛋白免疫小鼠后28天進行了5×LD50劑量的攻擊。結果表明，rGAPDH，rOapA和rHPS-0675三種重組蛋白具有很好的免疫保護效果，分別為75％，87.5％和75％。進一步將這三種蛋白單獨或混合形式以豬為感染模型進行了免疫反應和保護效力研究。結果表明，三種蛋白都能夠引起很好的體液免疫反應并分別提供70％，50％和70％的免疫保護，而混合蛋白免疫提供的免疫保護力最高，為80％。而

6、3種蛋白產生的抗體和混合蛋白的抗體在全血殺菌試驗中都能夠抑制細菌的生長。研究結果進一步提示rGAPDH, rOapA和rHPS-0675重組蛋白能夠介導針對副豬嗜血桿菌SH0165菌株感染的免疫保護，是重要的疫苗候選抗原，能夠研制開發(fā)成一種多組分通用型亞單位疫苗。
　　 ⑵副豬嗜血桿菌3-磷酸甘油醛脫氫酶DNA疫苗的構建及免疫效力研究。研究結果表明編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的gapA基因廣泛存在于15種標準血清型菌株中而且基因序列

7、比較保守，前期研究也顯示其是一種很好的疫苗候選抗原。因此我們進一步構建了GAPDH蛋白的DNA疫苗pCgap，并在小鼠感染模型中評價了該DNA疫苗免疫反應和針對血清4型菌株MD0322和血清5型菌株SH0165的攻擊所提供的免疫效力。結果表明，DNA疫苗通過肌內免疫小鼠之后能夠產生顯著的抗體反應。而且產生的抗體具有殺菌作用。DNA疫苗免疫小鼠7天之后能夠在肌肉、肝臟、脾臟和腎臟中檢測到轉錄產物。IgG亞類分析表明DNA疫苗可以同時誘導T

8、h1和Th2型免疫反應，但是IgG1型免疫反應強于IgG2a型免疫反應。此外，DNA疫苗能夠提供分別針對血清4型菌株MD0322攻擊的保護率83.3％和血清5型菌株SH0165攻擊的保護率50％。免疫組免疫保護力顯著高于陰性對照組和空白對照組。以上結果提示DNA疫苗pCgap為控制副豬嗜血桿菌的感染提供一個新的策略。
　　 ⑶副豬嗜血桿菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)免疫調節(jié)機理研究。研究表明，一些外膜蛋白通過修改宿主的免疫

9、系統(tǒng)來影響細菌在體內定植能力并且可以刺激宿主產生IL-2或者IL-10的能力。因此，本研究探討副豬嗜血桿菌外膜蛋白是否在參與調節(jié)宿主的免疫反應方面起著重要作用。通過將12種外膜蛋白(cdtB, GAPDH, HPS-2037, OmpP1, HPS-0220, HPS-0675, HPS-1406, HPS-1834,OapA，6PGD，HPS-1889，IdgA)體外刺激小鼠脾淋巴細胞，從中篩選到了外膜蛋白GAPDH能夠顯著上調脾臟細

10、胞表面CD69分子的表達。通過MTT實驗結果也表明GAPDH蛋白能夠促進脾臟淋巴細胞的增值和B細胞的分化。進一步構建了GAPDH過表達菌株GAO，開展了過表達菌株小鼠體內定植、誘導宿主產生細胞因子、中性粒細胞所介導的殺傷和對宿主免疫相關基因表達的影響等實驗。結果表明:GAPDH能夠促進機體對副豬嗜血桿菌的清除和誘導機體產生IL-2。與野生菌株相比，過表達菌株GAO更容易被中性粒細胞和小鼠的巨噬細胞所殺傷。而且，機體感染過表達菌株GAO之