雞miR-1666前體區(qū)SNP對其成熟體生成和其靶基因調控的影響.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是近年來鑒定的具有重要轉錄后調控功能的非編碼RNA，由于每個miRNA的靶基因眾多，而位于miRNA基因上的單核甘酸多態(tài)性(Single NucleotidePolymorphisms，SNP)能夠改變其加工過程或其對靶基因的選擇進而影響該miRNA功能的發(fā)揮，因此鑒定與揭示miRNA SNPs的功能與作用顯得尤為重要。本研究的主要目的是探究位于miR-1666前體區(qū)的SNP是否影響miRNA成熟體的生成，

2、揭示miR-1666的生物學功能以及該SNP對miR-1666功能的影響。該研究用生物信息學方法篩選出雞miR-1666前體區(qū)存在的SNP，以河南省家禽種質資源創(chuàng)新工程研究中心構建的固始雞-安卡雞F2代資源群為研究材料，DNA測序和PCR-RFLP的方法鑒定出位于資源群miR-1666基因的SNP并進行基因分型，與資源群的肉質性狀、生長性狀、屠體性狀等經濟性狀進行關聯(lián)分析初步揭示該SNP的功能;通過構建miR-1666不同等位基因的pE

3、G FP-N1表達載體并轉染DF1細胞，用熒光定量的方法檢測該SNP對成熟miRNA生成的影響;用雙熒光素酶報告系統(tǒng)結合熒光定量的方法鑒定和驗證miR-1666的靶基因，并探究該SNP對miR-1666靶基因調控的影響。本研究主要得到以下結果:
　　1.生物信息學結合測序鑒定的方法在固始雞和安卡雞F2代資源群中檢測到唯一一個位于miR-1666前體區(qū)上的突變位點即rs14120863(C/G)。與F2代資源群經濟性狀關聯(lián)分析表明，

4、該SNP與雞的半凈膛重、全凈膛重、胸肌重、腿肌重及部分體尺性狀包括脛圍、胸深、胸骨長和體斜長存在顯著關聯(lián)，且CC型個體顯著優(yōu)于GG型。
　　2.M-fold軟件預測顯示該SNP能夠引起堿基的錯配進而產生一個新的凸起且該SNP改變了miR-1666二級結構的最低自由能，自由能由G等位基因的-37.5kcal/mol改變?yōu)镃等位基因的-35.2kcal/mol，二級結構的穩(wěn)定性降低。熒光定量結果顯示固始-安卡雞F2代資源群中GG基因型

5、個體胸肌組織樣中成熟miR-1666的表達量顯著高于CC基因型;通過構建miR-1666不同等位基因的pEGFP-N1表達載體并轉染DF1細胞，熒光定量檢測表明G等位基因成熟miR-1666的表達顯著高于C等位基因，與上述結果相符。結果表明miR-1666前體區(qū)的rs14120863 SNP能夠影響成熟miR-1666的生成。
　　3.生物信息學的方法結合熒光定量技術篩選出ARF6, CBFB和TAB2為miR-1666的候選靶基

6、因，進而通過構建上述三個基因的psi-Check2雙熒光素酶報告載體，確定CBFB為miR-1666的一個靶基因，而ARF6和TAB2并非其靶基因。最終通過熒光定量檢測miR-1666不同等位基因對靶基因CBFB的調控作用，結果顯示該SNP能夠影響miR-1666對CBFB的調控能力。由以上試驗結果，可得出如下結論:
　　MiR-1666前體區(qū)的SNP能夠改變成熟miR-1666的表達量，進而影響miR-1666對靶基因CBFB的