口蹄疫病毒VP1基因C末端及豬α-β干擾素在大腸桿菌中的表達研究.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是危害世界各國畜牧業(yè)最嚴重的疾病之一,其病原是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV).預防和控制口蹄疫關鍵是疫苗和診斷方法.目前用于口蹄疫的診斷技術有多種,但ELISA是一種最經(jīng)濟、有效的方法之一.而傳統(tǒng)ELISA需要全病毒作為抗原或制備抗體,生產(chǎn)全病毒需要昂貴的培養(yǎng)基,且存在散毒的危險.一種可供替代的方法是將型特異性序列進行體外表達

2、,用表達產(chǎn)物作為檢測用抗原.此外,目前研究發(fā)現(xiàn)α/β干擾素對口蹄疫有很好的抗病毒效果.該研究擬從以下兩個方面進行:1.口蹄疫病毒VP1基因C末端串連表達及其抗體ELISA方法的初步建立 參照Taiwanse97(AJ294928)設計了一對特異性引物,從pcDNA-P1中克隆出VP1基因C末端,包括B細胞表位(141-160aa)和T細胞表位(200-213aa)序列分析表明:其C末端長285bp,編碼74個氨基酸,與O/HKN/12/

3、91、O/PEN/TAW/99核苷酸和氨基酸同源性分別為95﹪、93﹪和96﹪、93﹪;利用同尾酶XhoⅠ、SalⅠ將VP1基因C末端串聯(lián)起來;再將單拷貝和雙拷貝C末端基因插入到原核表達載體pGEX-KG后,轉(zhuǎn)化BL21(DE3),在IPTG誘導下獲得表達,經(jīng)Western blotting檢測證實表達產(chǎn)物具有活性.以表達產(chǎn)物包被ELISA板,初步建立了特異、敏感的ELISA診斷方法.同時用表達產(chǎn)物免疫BABL/c小鼠,能產(chǎn)生一定的抗O

4、型口蹄疫病毒的抗體.該研究將在研制新型疫苗和建立診斷方法等方面具有潛在的理論價值和應用前景.2.梅山豬α/β干擾素的克隆、定點誘變及原核表達 利用PCR技術從中國梅山豬白細胞總DNA中擴增出α/β干擾素基因(MS-IFNα/β),將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體,利用雙脫氧末端終止法測定了全基因的核苷酸序列.序列分析表明:β干擾素基因全長561bp,編碼186個氨基酸,與GenBank中S41178的序列同源性達到99﹪,在128、

5、177位核苷酸處發(fā)生了點變異,由G變?yōu)锳,T變?yōu)镃;但僅導致43位氨基酸由G變?yōu)镋;豬干擾素(MS-IFNα)全長570bp,編碼189個氨基酸的前體蛋白,其中含23個氨基酸的信號肽和166個氨基酸的成熟多肽,成熟多肽中含5個半胱氨酸,與GenBank中M28623的序列同源性為96﹪.通過巨引物法,分別對MS-IFNα基因(第86位氨基酸)和MS-IFNβ基因(第17位氨基酸)進行定點誘變.在此基礎上,通過PCR方法將編碼成熟蛋白基因