國(guó)槐高頻再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜菜堿醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、國(guó)槐(Sophora japonica L)又稱(chēng)槐樹(shù)、家槐,原產(chǎn)中國(guó),是豆科槐屬的落葉喬木,是一種集材用、藥用、食用、觀賞于一身的高效樹(shù)種,由于其具有生長(zhǎng)快、壽命長(zhǎng)、樹(shù)姿優(yōu)美、遮蔭面積大,耐干旱、抗逆性強(qiáng)等特性,在我國(guó)很多地區(qū)普遍栽培.為了進(jìn)一步提高國(guó)槐的耐鹽抗旱性,擴(kuò)大其適宜種植的范圍,獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益,本試驗(yàn)對(duì)國(guó)槐進(jìn)行了高頻再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽基因(BADH)轉(zhuǎn)化的研究.本項(xiàng)研究以?xún)?yōu)良耐鹽單株上的種子為材料,

2、建立了組培再生技術(shù)體系,進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BADH基因轉(zhuǎn)化研究,希望通過(guò)基因轉(zhuǎn)化生物技術(shù)獲得抗鹽新種質(zhì).本試驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:1.建立了國(guó)槐大葉片再生體系.國(guó)槐大葉片在誘導(dǎo)芽的分化培養(yǎng)基上表現(xiàn)出較高的分化能力,此大葉片為建立國(guó)槐再生體系的最佳外植體.大葉片在分化培養(yǎng)基MS+6-BA4.0mg.L<'-1>+IBA0.25mg.L<'-1>(簡(jiǎn)稱(chēng)MA)上分化效果最好,在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)60天(暗培養(yǎng)10~15天)后平均每個(gè)大葉片可分化出8

3、~9個(gè)芽.從國(guó)槐大葉片創(chuàng)傷后進(jìn)行暗培養(yǎng)啟動(dòng)分化,到大葉片上有再生芽出現(xiàn)以及后面的繼代快繁培養(yǎng),均用同一種培養(yǎng)基,建立了一個(gè)及為簡(jiǎn)捷的再生體系.國(guó)槐幼苗的生根率很低,即使在生根效果最好的培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.5mg.L<'-1>+蔗糖30mg.L<'-1>上,生根率也僅為33﹪.如何提高生根率還需進(jìn)一步研究.2.建立了BADH基因轉(zhuǎn)化體系.頭孢霉素濃度為400mg.L<'-1>時(shí)抑制和去除農(nóng)桿菌效果最佳,同時(shí)該濃度的頭孢霉素對(duì)國(guó)槐大

4、葉片愈傷組織的形成及芽分化影響不大.國(guó)槐大葉片對(duì)卡那霉素較再生出的幼苗敏感,在Kan25mg.L<'-1>時(shí)就完全抑制芽的分化,本試驗(yàn)采用延遲選擇的方法,在延遲選擇的不同階段所用選擇壓不同,這樣的選擇方法顯著提高了轉(zhuǎn)化效率.以侵染后具有再生能力的大葉片百分率和產(chǎn)生抗性芽數(shù)量為評(píng)價(jià)依據(jù)建立和優(yōu)化了轉(zhuǎn)化體系;大葉片無(wú)需預(yù)培養(yǎng),用其分化培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基重懸菌液,侵染濃度為OD<,600>值0.3~0.5;侵染時(shí)間10~15分鐘;共培養(yǎng)2~3天