重組甜菜夜蛾核多角體病毒SeLV1的研究.pdf

1、該文通過同源重組的方法,缺失了甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodopteraexigua multicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)基因組中的非必需基因--脫皮甾體尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶基因(ecdysteroid UDP glucosyl transferase,egt),并將綠色熒光蛋白基因(green fluorecentprotein,gfp)整合在egt基因位點,構建得到了重組病毒SeLV1

2、.然后對其進行了進一步的鑒定分析,為繼續(xù)構建高效的重組桿狀病毒殺蟲劑提供了重要的技術基礎.在野生型SeMNPV中存在缺失了不同片斷的多種基因型.為了構建重組病毒SeLV1,首先通過蟲體克隆的方法,從SeMNPV的野外分離株SeUS1中分離得到了具有SeMNPV完整基因組的基因型克隆--SeC,用多種限制性內切酶對其基因組進行REN分析,所得的酶切圖譜中均無亞克分子帶出現,證明其具備了完整的病毒基因組.為了便于篩選分離重組病毒,將報告基因

3、gfp插入到egt基因的上下游側翼序列之間,并以克隆載體pUC18為基礎,構建成轉移載體pEGT-GFP<'+>.為確保基因能順利表達,還在其起始密碼子ATG前插入了苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的多角體基因的啟動子.用構建好的轉移載體pEGT-GFP<'+>和具有完整基因組的SeC的DNA,通過脂質體法共轉染Se3

4、01細胞.在熒光顯微鏡下可以觀察到部分被感染的細胞有綠色熒光產生,證明重組成功.在GFP篩選標記的幫助下,利用空斑純化法分離得到了重組病毒SeLV1.對其基因組進行的REN和Southern blot分析證明gfp基因已經成功地整合在egt基因位點,但同時在原來Pst I-C片斷上發(fā)現存在6.9kb的缺失.通過透射電鏡發(fā)現SeLV1的多角體大小不均一,和SeC的多角體存在較大差異.口服感染甜菜夜蛾幼蟲的實驗證明,SeLV1已經失去了對甜