23942.植物乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因的定點突變研究

1、分類號Q93學(xué)校代碼10129UDC579學(xué)號08210001植物乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因的定點突變研究SiteDirectedMutagenesisofLinoleateIsomeraseGenefromLactobacillusPlantarum申請人：劉海霞學(xué)科門類：理學(xué)學(xué)科專業(yè)：微生物學(xué)研究方向：微生物分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：趙國芬教授論文提交日期：二〇一一年五月摘要共軛亞油酸(conjugatedlinoleicacids簡稱CLA

2、)是一種具有多種生理活性的天然脂肪酸，CLA具有抗癌、降低膽固醇、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生理功能。亞油酸異構(gòu)酶可將亞油酸轉(zhuǎn)化為生物活性的CLA。目前，亞油酸異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究以及利用生物工程和基因工程對亞油酸異構(gòu)酶進(jìn)行有效地改造已成為熱點。但是在微生物發(fā)酵生產(chǎn)CLA的代謝途徑和機(jī)理方面研究甚少，有待進(jìn)一步深入研究。本實驗以植物乳桿菌（Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumP8）基因組為模板，設(shè)計引

3、物，通過PCR擴(kuò)增得到亞油酸異構(gòu)酶基因，將其克隆到pMD19T載體測序鑒定后，再亞克隆到表達(dá)載體pQE30中，雙酶切鑒定表達(dá)載體pQE30LAI成功構(gòu)建。用:www.ncbinlm.nih.govblast和vecterNTI等軟件工具對亞油酸異構(gòu)酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析并預(yù)測酶關(guān)鍵氨基酸，預(yù)測結(jié)果確定亞油酸異構(gòu)酶的必要氨基酸為193位苯丙氨酸，將其定為突變位點，改變578位堿基T為C，將苯丙氨酸極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性氨基酸絲氨酸。設(shè)計突變

4、引物，以重組質(zhì)粒pQE30LAI為模板，用Transgen公司開發(fā)的QuickChange定點突變試劑盒進(jìn)行定點突變，成功構(gòu)建突變載體pQE30F193LAI。突變前后的亞油酸異構(gòu)酶在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別用提取的粗酶和菌體直接催化測定酶活力，酶催化的結(jié)果分別為野生型1999.79Uml，突變型1564.53Uml，菌體催化的結(jié)果分別為野生型117.11Uml，突變型87.96Uml。兩種結(jié)果均表明，重組菌pQE30LAI的