柑桔裂皮類(lèi)病毒快速檢測(cè)技術(shù)的研究及湖北分離物的克隆.pdf

1、該研究采用聚丙酰胺雙向凝膠電泳、反轉(zhuǎn)錄-PCR和核酸雜交三種方法對(duì)柑桔裂皮類(lèi)病毒進(jìn)行了快速檢測(cè)方法的研究,并成功地分離到了柑桔裂皮類(lèi)病毒的湖北分離物,對(duì)春進(jìn)行了鑒定和序列分析,具體研究結(jié)果如下:1、柑桔裂皮類(lèi)病毒快速檢測(cè)技術(shù)體系的建立聚丙燃酰胺雙向凝膠電泳法檢測(cè):將從陽(yáng)性材料上提取的類(lèi)病毒核酸,先在6﹪的聚丙烯酰胺非變性膠上進(jìn)行第一向電泳,然后切割含類(lèi)病毒分子的膠條,在變性條件下進(jìn)行垂直或反向電泳,最后銀染觀察.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),陽(yáng)性樣品的落后

2、于寄主植物核酸帶的位置均可見(jiàn)一條類(lèi)病毒分子帶,而陰性對(duì)照則沒(méi)有這條帶.該方法具有快速簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn).反轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè):參考已報(bào)道的CEVd核苷酸序列合成引物,分別對(duì)中柑所和意大利陽(yáng)性樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)在370bp左右的位置上有特異性擴(kuò)增條帶,而且可以應(yīng)用于待檢樣品的檢測(cè).該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性高,檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、可靠,尤其適合于田間樣品的大規(guī)模檢測(cè).核酸雜交法檢測(cè):利用已經(jīng)克隆的美國(guó)柑桔裂皮

3、類(lèi)病毒cDNA序列,制備生物素標(biāo)記的核柑酸探針,采用班點(diǎn)雜交的方法和組織印跡的方法分別對(duì)陽(yáng)性材料進(jìn)行雜交檢測(cè),通過(guò)膠片曝光顯示雜交信號(hào),發(fā)現(xiàn)在兩種方法的檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性材料都有強(qiáng)的反應(yīng),而陰性材料無(wú)反應(yīng)或較弱,該方法安全可靠、快速準(zhǔn)確,適合大量樣品的檢測(cè).2.柑桔裂皮類(lèi)病毒湖北株系的分離鑒定與測(cè)序從湖北省秭歸縣采集羅伯遜臍橙枝條,采用聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳、RT-PCR及Dot-blotting方法檢測(cè)到了柑桔裂皮類(lèi)病毒,然后將其嫁接于指