草莓栽培品種離體再生及遺傳轉化的研究.pdf

1、 獨 創(chuàng) 性 聲 明本人聲明: 所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的 研究工作及取得的 研究成果。 盡我所知， 除了文中 特別加以標注和致謝的地方外， 論文中不包含其他人己 經發(fā)表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得中國農業(yè)大學或其他它教育機構的學位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做出的任何貢獻，均己在論文中作了明確說明并表示了謝意。研 究 生 簽 “ : 甲 礴) - “介年

2、3月 I 日關于論文使用授權的說明本人完全了 解中國 農業(yè)大學有關保留、 使用學位論文的規(guī)定， 即: 學校有權保留送交論文的復印 件及磁盤， 允許論文被查閱和借閱， 可以 采用影印、 縮印或掃描等復制手段保存、 匯編學位論文。 同意中國農業(yè)大學可以 用不同方式在不同媒體上發(fā)表、 傳播學位論文的 全部或部分內容。( 保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議)研究生簽名: 3 月導師簽名: 子 一 月/ 日/ / 日功國農坐 試. 筍娜1動t 尹

3、玻舉二， 有 徽賽若召禪浦布粵生漢遺洋洋必必開男制 農桿菌的 生長， 此時“ 哈尼” 不定芽 再生率略有下降。 繼續(xù) 提高C a r b 濃度至5 0 0 m g / l ,再生頻率明 顯下降。( 二) C B F I 基因對草墓的遺傳轉化1 . 基因型是影響草毒遺傳轉化的 重要因素。 對再生頻率較高的“ 豐香” 、 “ 哈尼” 、 “ 土特拉” 、 “ 達斯萊克 特” 四 個基因型進行了 轉化， 分別 得到了3 . 5 7 %,

4、4 . 8 1 % , 2 . 1 5 % , 1 3 . 7 %的轉化頻率。2 . 經乙 WT香 酮 ( A S , 5 0 , 1 0 0 m g / 1 ) 、 水 楊酸 ( S A , 5 0 , 1 0 0 m g / l ) 分y 9 1 處 理6 h 的農桿菌侵染葉盤， 可以 顯著提高 “ 哈尼” 的 轉化頻率; 對于葉柄， 經A S 1 0 0 m g / l 處理后轉化頻率由8 . 3 3 % 提高到

5、了 1 8 . 3 3 %, 其它處理對轉化率沒有影響。3 . 對于L B A 4 4 0 4介導的基因 轉化， 葉盤在菌液中 浸泡 1 -7 m i n都是可行的: 農桿菌和外植體共培養(yǎng)時間在2 - 4 d 的范圍內， 都得到了 較好的結果，以 共培養(yǎng)4 d為佳。 在分化培養(yǎng)基中預培養(yǎng)2 - 4 d 的“ 土特拉” ， 抗性芽的誘導率高于未經處理及預培養(yǎng)6 d 的 處理， 預培養(yǎng)2 d 時抗性芽的 誘導率最高。 對于 “ 哈尼”

6、和 “ 豐香” ， 預培養(yǎng)則降 低了 抗性芽的誘導率。4 . 選擇方式對草萄的遺傳轉化率影響很大。 對于 “ 土 特拉” ， 前期選擇不利于轉化細胞的生長， 未能獲得轉化芽， 宜采取延遲選擇或后期選擇的方式。 對于 “ 豐香” ， 延遲選擇和后期選擇都明 顯提高了 轉化率， 尤以后期選擇更為明顯。 對于 “ 哈尼” ，前期選擇和延遲選擇對轉化率的影響不大， 但后期選擇同 樣促進了 轉化率的提高。 因 此， 對于草驀葉盤的遺傳轉化，共培養(yǎng)

7、之后不立即進行抗性篩選， 而在脫菌培養(yǎng)基中恢復生長一定階段，對于獲得轉化體很重要。 后期選擇時， 抗生素能夠有效地淘汰非轉化芽， 從而避免嵌合體的產生。5 . 以0 . 5 m n 、 大小、 帶 有2 - 4 個葉 原基的 生 長點為 外 植體 進行轉 化， “ 豐香” 、 “ 星都1 號” 、 “ 星都2 號” 等 3 個品 種分別得到了3 7 . 5 % 、 2 0 % 、 3 3 . 3 % 的轉化率。 但利用生長點進行轉化存在

8、著取材時間受限 制、 操作耗時、 帶菌嚴重、 污染率高以 及容易出 現嵌合體等局限性。6 . 對1 9 8 個 抗性植 株株系 進行了P C R 檢測， 其中5 4 個 株系的D N A經 擴增后產生了與 陽 性 對 照 相 同 的 特 異 擴 增 帶， 其 片 段 大 小 約 為6 4 0 b p ， 與( ; B F I 相 符。 對P C R陽 性 植株和對照植株進行了雜交檢測， P C R陽性條帶均有陽性反應信號， 而P C R

9、陰 性條帶未檢測到雜交信號。 這表明外源基因已 整合進草夸轉化植株的基因組中。7 對轉基因 株系2 0 1 0 - 5 - 5 及對照品種“ 哈尼” 進行了 生物學性狀的比 較， 轉基因 植株在植株、 葉片、 花序、 種子、 甸旬莖、 果實 等方面與 對照品 種并 無明 顯差異。 但在開 花結果時期上， 卻明顯地早于對照品種， 盛花期早于對照8 d , 盛果期早于對照1 1 d .8 . 經生長恢復實驗及電導法測定葉片的 抗寒性后表明