18682.植原體免疫膜蛋白imp的原核表達及多克隆抗體制備

1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝二￡E√恩0學位論文作者簽名：竺咝簽字日期：2012年5月30目學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學有關

2、保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權安徽農(nóng)業(yè)大學可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文(保密的學位論文在解密后適用本授權書)。學位論文作者簽名：爹磁指導教師簽名：簽字日期：2012年5月30日簽字日期：2012年5月30日于葡晏植原體免疫主導膜蛋白(Imp)是植原體免疫膜蛋白系統(tǒng)中重要的成員，

3、在植原體傳播、致病的過程中可能起著關鍵的作用。對植原體膜蛋白組的研究，可探尋植原體致病機理，：另通過免疫獲得植原體各膜蛋白特異性抗體可制備高通量蛋白質檢測芯片。本實驗開展了原核誘導表達Imp，親和層析純化目的蛋白以及Imp多克隆抗體制備等一系列：工作。本研究以重組克隆質粒pMDl8Timp為模板，利用含NdeI、XhoI酶切位點的引物PCR擴增Imp基因片段，構建重組表達載體pET28a()imp，轉化宿主菌EcoliBL21(DE3)

4、。PCR、雙酶切及測序結果顯示重組質粒pET28a()imp構建成功。經(jīng)IPTG誘導、SDSPAGE電泳分析，重組菌BL21(pET28a()imp)表達出大小約20kD的蛋白，與預期的攜帶6HisTag的目的蛋白(195rD)大小相符。Westernblotting檢測HisTag，結果顯示帶有6HisTag的Imp融合蛋白在大腸桿菌中能夠成功表達?？扇苄苑治鲲@示，表達的Imp融合蛋白在大腸桿菌體系內以可溶蛋白和包涵體兩種形式存在，主

5、要為包涵體蛋白。重組菌BL21(pET28a()imp)培養(yǎng)條件正交實驗結果表明，最佳培養(yǎng)條件參數(shù)為：溫度37。C，pH70，裝液量20％。重組菌培養(yǎng)8h達到穩(wěn)定期。根據(jù)方差分析，一定的范圍內，培養(yǎng)溫度對重組菌生長影響最顯著，各因素影響主次為：溫度裝液量pH。誘導條件正交實驗結果表明，最佳誘導條件組合為：溫度37。C，起始OD600≈15，IPTG終濃度01mmol／L，誘導培養(yǎng)6h。根據(jù)方差分析，誘導溫度與誘導起始OD600值對Imp

6、的表達量影響最顯著，各因素影響主次為：誘導溫度誘導起始OD600值誘導時間IPTG終濃度。實驗結果顯示誘導物IPTG與目的蛋白表達對重組菌的生長產(chǎn)生影響，菌體的生長量與融合蛋白的表達量呈線性相關。以優(yōu)化條件發(fā)酵重組菌，融合蛋白Imp的表達量約為70mg／L。原核表達載體pET28a()表達的融合蛋白帶有6HisTag，Ni—NTAHisBind樹脂作為親和材料純化融合蛋Imp。200ml發(fā)酵菌體裂解液與lml的樹脂結合，使用8ml含40

7、mg咪唑的洗滌緩沖液可除去絕大部分雜蛋白，4ml含300mM咪唑的洗脫緩沖液可基本洗脫目的蛋白。研究表明以包涵體為材料，變性條件下純化獲得較高濃度與純度的Imp蛋白。純化的可溶性蛋白透析脫咪唑，濃縮獲得08mg／mlImp蛋白溶液，純度95％。將純化的融合蛋白免疫家兔后，成功獲得了兔抗Imp多克隆抗體。間接ELISA法測定抗體效價為1：128，000，Westernblotting分析制備的多克隆抗體與Imp蛋白發(fā)生特異性反應。關鍵詞：