PRRSV GP5蛋白與泛素融合蛋白基因重組質粒的構建與免疫特性研究.pdf

1、　　豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是目前危害養(yǎng)豬業(yè)重要的病原之一。GP5蛋白是該病毒的主要保護性抗原，含有中和性抗原表位，但豬感染PRRSV后產生中和抗體的時間較晚，而且其滴度較低。泛素(簡稱Ub)是一個由76個氨基酸殘基組成的非常保守的小蛋白質。本研究將Ub基因插入GP5基因5端，旨在有效的將糖基化蛋白分解成小的多肽，促進不同抗原表位提呈，增強免疫效果，為PRRSVDNA疫苗提供理論依據(jù)。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的PRRSVS

2、1毒株GP5基因序列設計合成了兩對分別含有BglⅡ、NotⅠ酶切位點的引物，以pcDNA3-ORF5質粒為模板用PCR技術獲得大小為620bp左右的目的產物，經(jīng)純化后與真核表達載體pCMV-Ub同時進行酶切，分別經(jīng)回收后連接。連接產物轉化DH5α感受態(tài)細菌，然后在氨芐青霉素抗性(AmpR)平板上挑取陽性菌落，過夜培養(yǎng)，提取質粒，經(jīng)單酶切、雙酶切鑒定及DNA序列測定。用DNAStar軟件分析結果表明：擴增片段與預期片段大小相符，且完全符合

3、載體閱讀框。該毒株GP5基因序列與美洲標準毒株和其它分離株的基因同源性為99﹪。最后分別命名為pCMV-Ub-GP5、pCMV-GP5。　　用PEG2000提取純化了重組質粒pCMV-GP5和pCMV-Ub-GP5，將重組質粒組以100μg背部皮內注射免疫BALB/c小鼠，以間隔15天的頻率共免疫4次，用中和抗體試驗和ELISA試驗測定不同時間小鼠血清PRRSV抗體，以比較GP5基因和與泛素融合表達GP5基因的免疫特性。結果表明，第三

4、次免疫后14天(即首免后44天)pCMV-Ub-GP5和pCMV-GP5免疫組的小鼠血清ELISA試驗OD490值均能達到1.0，且均可檢測到中和抗體的存在，在第4次免疫后14d(即首免后59d)中和抗體平均滴度為7和12，抗體產生時間和抗體滴度差異不顯著?！　∫陨涎芯拷Y果表明，本文成功構建了PRRSVGP5蛋白和泛素融合蛋白基因重組質粒pCMV-GP5和pCMV-Ub-GP5。重組質粒DNA免疫小鼠都能誘導產生抗PRRSV的特異性體