腎安Ⅱ號(hào)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠GMC增殖及TNFa、NF-KB表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)，觀察腎安Ⅱ號(hào)對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及NF-KB和TNF-a表達(dá)的影響，進(jìn)而探討其阻緩腎纖維化的可能作用機(jī)制。 方法：1.直接購買大鼠GMC細(xì)胞株，應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行大鼠腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)，并選擇脂多糖為刺激物。 2.在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中，按不同分組：①GMC組(普通培養(yǎng)液)；②LPS組(含LPS的培養(yǎng)液)；③腎安組(含不同濃度腎安Ⅱ號(hào)的培養(yǎng)液)，分別加入不同

2、培養(yǎng)液，于培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)觀察。 3.用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法測(cè)含不同濃度腎安Ⅱ號(hào)培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞活力，觀察腎安Ⅱ號(hào)對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的毒性作用，從而確定實(shí)驗(yàn)用含腎安Ⅱ號(hào)培養(yǎng)液的合理濃度。 4.在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中，按不同分組加入不同培養(yǎng)液：①GMC組；②LPS組；③腎安低劑量組；④腎安中劑量組；⑤腎安高劑量組，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法，于24

3、小時(shí)、和48小時(shí)觀察各組標(biāo)本中大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖水平，進(jìn)而選擇藥物作用的最佳濃度及時(shí)間段。 5.在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞中，按不同分組加入不同培養(yǎng)液：①GMC組；②LPS組；⑨腎安組，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)法觀察各組標(biāo)本中大鼠腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)NF-KB和TNF-a的情況。 結(jié)果：1.大鼠腎小球系膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)結(jié)果經(jīng)傳代培養(yǎng)后的大鼠腎小球系膜細(xì)胞，一般24小時(shí)全部貼壁，純度極高，生長(zhǎng)迅速，很快融合成片，密集時(shí)可

4、重疊生長(zhǎng)，2-3天即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)成功且符合實(shí)驗(yàn)要求。 2.大鼠腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果在倒置顯微鏡下觀察，可見正常組大鼠腎小球系膜細(xì)胞體積較大，且純度極高，形態(tài)多為梭形或星形。經(jīng)HE染色后，位相顯微鏡下見細(xì)胞結(jié)構(gòu)十分清晰，胞漿內(nèi)可見大量微絲樣結(jié)構(gòu)，核居中央，多呈圓形或橢圓形，核周胞質(zhì)散布大量的細(xì)胞小顆粒。與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。經(jīng)LPS處理24小時(shí)后，光鏡下可見LPS組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生明顯，細(xì)胞體積增大，但附壁

5、能力弱，易脫落，相鄰細(xì)胞間連接性有所降低。48小時(shí)后大鼠腎小球系膜細(xì)胞體積有所縮小，形態(tài)變圓，核固縮開始出現(xiàn)，核顏色加深，折光性增強(qiáng)。而經(jīng)中藥腎安Ⅱ號(hào)處理的腎安組大鼠腎小球系膜細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，幾乎無脫落，胞漿飽滿，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片。形態(tài)學(xué)觀察與正常組一致。 3.大鼠腎小球系膜細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色排斥試驗(yàn)顯示：腎安Ⅱ號(hào)25％，12.5％和6.25％濃度組24小時(shí)，48小時(shí)和72小時(shí)細(xì)胞活力均達(dá)90％以上。經(jīng)X2檢驗(yàn)，

6、腎安Ⅱ號(hào)上述三組細(xì)胞活力與空白組比較，無顯著性差異(P＞0.05)。 4.大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖測(cè)定結(jié)果MTT法測(cè)OD值顯示：(1)腎安Ⅱ號(hào)24小時(shí)和48小時(shí)對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的抑制作用與濃度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.979和0.991，P＜0.05)；(2)LPS組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生水平明顯高于GMC組(P＜0.01)；(3)腎安Ⅱ號(hào)各濃度組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生水平明顯低于LPS組(P＜0.01)。 5.大鼠

7、腎小球系膜細(xì)胞中NF-KB、TNF-a表達(dá)結(jié)果免疫細(xì)胞化學(xué)染色(48h組)顯示：(1)三組標(biāo)本中均有不同程度的NF-KB和TNF-a的陽性表達(dá)；(2)LPS組NF-KB、TNF-a表達(dá)明顯高于GMC組(P＜0.01)；(3)腎安組NF-KB、TNF-a表達(dá)與GMC組無顯著性差異(P＞0.05)；(4)腎安組NF-KB、TNF-a表達(dá)明顯低于LPS組(P＜0.01)。 結(jié)論：本研究表明：1.腎安H號(hào)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞無