水包油包納米粒亞微乳劑的研究.pdf

1、增加難溶性藥物的溶解度是藥劑學研究的熱點之一，而油水均不溶性藥物給藥系統(tǒng)的研究更是其中的難點問題。本課題將納米粒和水包油（O/W）亞微乳相結合，制成新型的水包油包納米粒（N/O/W）亞微乳給藥系統(tǒng)，將納米粒包載在亞微乳的油相中，以達到增加制劑中難溶性藥物載藥量的目的。制劑中采用生物相容性好的輔料，安全性好，可實現難溶性藥物的靜脈注射給藥。N/O/W亞微乳可進一步制成干乳劑，提高穩(wěn)定性不好的藥物在制劑中的穩(wěn)定性。雙氫青蒿素（Dihydro

2、artemisinin，DHA）是青蒿素經還原而成的半縮醛化合物，具有良好的抗瘧作用，近代研究表明DHA對多種人類和動物腫瘤細胞均有殺傷作用，且治療濃度下對正常細胞幾乎無毒性作用，有希望發(fā)展成為新型的抗腫瘤藥物。DHA為難洛性藥物，分子結構中存在特殊的過氧基團，穩(wěn)定性差，胃腸道降解嚴重，生物利用度低。本研究以雙氫青蒿素為模型藥物，采用生物相容性好的輔料制備了注射用DHA N/O/W亞微乳劑，可實現DHA的靜脈注射給藥。同時針對DHA穩(wěn)定

3、性不好的特點，進一步制成千乳劑，提高DHA在制劑中的穩(wěn)定性。 本課題建立了DHA的HPLC含量測定法，考察了DHA在溶液中異構體的轉化平衡情況，α-DHA與β-DHA在溶液中達到平衡所需時間約為10h，平衡后二者的比例不再變化，比例約為2．3（α/β）。在轉化過程中DHA異構體總峰面積基本保持恒定，對DHA的HPLC分析可用α-DHA與β-DHA峰面積之和與濃度進行線性回歸，計算DHA的含量。測定了DHA在不同溶媒中的溶解度，D

4、HA在水和大豆油中的表觀溶解度分別為0．119±0．021和1．24±0．01mg/mL，在水和大豆油中加入不同乳化劑后，均能提高DHA的溶解度，其中以大豆油/大豆磷脂/膽固醇最為顯著。 以注射用大豆油、大豆磷脂、膽固醇和穩(wěn)定劑C為油相，Poloxamer188、甘油為水相，采用微射流技術制備DHA N/O/W亞微乳。乳劑外觀為乳白色液體，無油花，不掛壁，用水稀釋后有淡藍色乳光。平均粒徑為152±18nm（PDI0．078±0．

5、018），Zeta電位為-33．28±2．07mV，pH值為7．18±0．03，符合注射要求。DHA N/O/W亞微乳中藥物含量為2．98±0．03mg/mL，載藥量約為DHA O/W亞微乳最高載藥量的3倍。以DHA O/W亞微乳作為對照，分別在光學顯微鏡、透射電鏡、冷凍蝕刻透射電鏡下觀察不同粒徑DHA N/O/W亞微乳的形態(tài)。結果顯示，DHAN/O/W亞微乳呈橢圓狀，邊緣光滑，乳滴大小較均勻，乳滴中包含有顆粒狀物質，DHA O/W亞微

6、乳中則未觀察到有顆粒狀物質存在。冷凍蝕刻透射電鏡可見DHA N/O/W亞微乳乳滴斷面不平整，具有類似于層紋或殼狀的結構存在，而DHA O/W亞微乳的乳滴斷面較光滑平坦。以多種可代表DHA納米粒不同狀態(tài)的DHA制劑和DHA純品為對照，進行DHA N/O/W亞微乳的DSC分析試驗。與DHA純品相比，DHA N/O/W亞微乳劑和DHA油混懸液中DHA的熔點下降了接近10℃。而DHA水混懸液和模擬DHA分散在N/O/W亞微乳水相的制劑中DHA熔

7、點與DHA純品的熔點相近。通過DHA的熔點變化情況判斷，DHA N/O/W亞微乳劑中DHA的存在位置應在制劑的油相中，與顯微鏡的結構觀察結果相符。 考察了DHA在N/O/W亞微乳中的分布情況。經測定DHA N/O/W亞微乳劑約有8．06％的藥物溶解在水相中，91．9％的藥物存在在油相中。其中有13．8％的藥物溶解在油相中，其余78．1％的DHA存在于界面膜和油相的納米粒中。 以甘露醇：蔗糖（4：1）為凍干保護劑制備了DH

8、A N/O/W干乳劑，干乳中凍干保護劑與油相的比例為2：1（w/w）。凍干過程為DHA N/O/W亞微乳與凍干保護劑混合均勻后，在-40℃迅速冷卻預凍6小時，然后在-40℃真空干燥4小時，-40℃-0℃真空干燥8小時，升溫至20℃持續(xù)4小時去除殘余水分，凍干過程中壓力保持在30-50mTorr，冷凝器溫度控制在-80℃。 建立了DHA有關物質的HPLC分析法，采用強制破壞法制備了在強酸、強堿、光照、高溫和氧化條件下破壞的樣品，找

9、到了7個DHA的降解產物。DHA的降解產物在本分析方法下均能達到良好分離，本法可用于DHA制劑的穩(wěn)定性研究。 考察了DHA、DHA N/O/W亞微乳劑和DHA N/O/W干乳劑的穩(wěn)定性。結果表明，DHA對光照和高溫敏感，在濕度較高的環(huán)境下含量也有改變，故應低溫干燥避光保存。考察了DHA在溶液中的穩(wěn)定情況。與DHA溶液相比，DHA N/O/W亞微乳的穩(wěn)定性已有提高，但對溫度仍然很敏感，在光照條件下不穩(wěn)定。DHAN/O/W亞微乳需放

10、置在4℃，充氮避光密閉保存．對DHA N/O/W干乳劑進行了加速試驗和長期留樣觀察。DHA N/O/W干乳經25℃、60％ RH加速試驗6個月，含量下降4％，復溶時間略微延長，粒徑分布、Zeta電位和pH值沒有顯著變化。4℃長期留樣觀察9個月內制劑性狀、藥物含量等均無明顯變化。在此條件下DHAN/O/W干乳劑質量穩(wěn)定，長期試驗仍在進行中。 通過異常毒性檢查、血管刺激性試驗以及溶血性試驗對DHA N/O/W亞微乳劑的安全性進行了初

11、步評價。DHA N/O/W亞微乳劑對小鼠的異常毒性試驗合格，制劑在生產過程中未帶來異常的毒性。對家兔耳緣靜脈無明顯刺激作用，對家兔紅細胞無明顯體外溶血及致凝集作用，DHA N/O/W亞微乳劑用于靜脈注射是安全的。 建立了體內樣品中DHA含量測定的HPLC-MS分析方法。方法專屬性好，內源性雜質對樣品測定無干擾，樣品處理簡單，精密度、回收率均符合規(guī)定，可用于DHA的體內分析。以DHA和DHA O/W亞微乳劑為對照，考察了DHA N

12、/O/W亞微乳劑與家兔、大鼠和人血漿的血漿蛋白結合情況。在本試驗研究的濃度范圍內，不同濃度的DHA制劑在同種血漿中的蛋白結合率無顯著差異，蛋白結合率與藥物濃度無關。不同制劑在同種血漿中的蛋白結合率也沒有顯著差異。不同種血漿當中，DHA與家兔的血漿蛋白結合率較高，其次為大鼠和人的，DHA與血漿蛋白具有中等強度的結合，平均血漿蛋白結合率分別76．36％、66．34％和63．94％。 家兔體內藥動學研究結果顯示，DHA N/O/W亞微

13、乳和DHA O/W亞微乳可以顯著延長DHA的體內循環(huán)時間，提高血漿中藥物濃度。DHA N/O/W亞微乳和DHA O/W亞微乳的MRT分別為DHA溶液劑的的10．39和3．42倍，DHAN/O/W亞微乳為DHA O/W亞微乳的3．03倍。DHA N/O/W亞微乳和DHA O/W亞微乳的AUC分別為DHA溶液劑的3．01和1．80倍，DHA N/O/W亞微乳為DHAO/W亞微乳的1．67倍。小鼠組織分布研究表明，DHA在體內迅速轉化成一未知

14、成分，在血液樣品中可觀察到轉變情況，各組織中僅檢測到該成分的存在。經固相萃取分離提取，HPLC-MS分析得到該成分的質譜圖，該成分具有m/z267．1的碎片離子峰提示其結構中仍有過氧基團的存在，應仍具有與DHA類似的藥效?？疾炝嗽摮煞衷谛∈篌w內的消除分布規(guī)律，研究DHA N/O/W亞微乳劑的組織分布趨勢。結果表明，DHA亞微乳劑可延長藥物在體內組織臟器中的滯留時間，在肝的攝取最高。DHA N/O/W亞微乳劑和DHA O/W亞微乳劑的體內

15、分布趨勢有所不同，DHA N/O/W亞微乳劑在心臟的分布降低，而在血中的滯留時間和在胃、腦中的分布增加。 以H22荷瘤小鼠模型進行DHA N/O/W亞微乳劑抗腫瘤藥效學的研究。乳劑給藥劑量為45mg/kg時，抑瘤率達51．8％（P<0．01），給藥劑量為11．25mg/kg時，抑瘤率為23．0％，低劑量乳劑組藥效略高于同等劑量的溶液組，高劑量的溶液對照組給藥后溶媒毒性超過了動物的耐受劑量，因此未得到高劑量溶液組的數據。結果表明，

16、45mg/kg的DHA N/O/W亞微乳劑對H22腫瘤細胞具有顯著抑制效果。對小鼠腫瘤的免疫組化結果分析表明，DHA可下調VEGF的表達，高劑量乳劑組尤為明顯，對各組組織切片的MVD觀察結果表明，MVD與VEGF表達結果趨勢相同，DHA可能是通過抑制腫瘤細胞的血管生成來抑制腫瘤的生長。 通過DHA N/O/W亞微乳的處方與工藝篩選、制劑特征、穩(wěn)定性、安全性考察，動物組織分布、體內藥物動力學、以及抗腫瘤作用的研究，表明N/O/W亞

17、微乳具有以下優(yōu)點：（1）可提高油水均不溶性藥物的載藥量；（2）使用生物相容性好的輔料，制劑安全性好，可適用于靜脈注射給藥；（3）以亞微乳作為納米粒的載體，可增加納米制劑的物理穩(wěn)定性；（4）可進一步制成千乳劑，增加不穩(wěn)定藥物的化學穩(wěn)定性；（5）能夠改變藥物在體內的組織分布和藥物動力學性質，有可能進一步開發(fā)成靶向制劑；（6）易于工業(yè)化生產。本課題為N/O/W亞微乳新劑型的研究奠定了基礎，為難溶性藥物給藥系統(tǒng)的研發(fā)提供新思路。DHA N/O/