氣單胞菌安徽分離株的鑒定、毒力基因檢測及其序列分析.pdf

1、　　本文擬以15株疑似氣單胞菌為研究對(duì)象，采用細(xì)菌數(shù)值鑒定法證實(shí)分離菌為不同表型種氣單胞菌的基礎(chǔ)上，建立了一種可同時(shí)用于氣單胞菌病快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查的多重PCR方法，并應(yīng)用該方法檢測安徽分離株攜帶毒力基因情況，探明我省氣單胞菌的分子流行病學(xué)特征，為該病的快速診斷、監(jiān)測和綜合防治提供方法和科學(xué)依據(jù)。　　首先，采用細(xì)菌數(shù)值鑒定法和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)15株分離菌進(jìn)行數(shù)值鑒定和致病性測定。研究中采用革蘭氏陰性桿菌七位編碼鑒定試劑盒對(duì)分離菌進(jìn)行

2、數(shù)值鑒定，結(jié)果顯示15株分離菌均為氣單胞菌，但表型種有所不同。　　其次，建立用于氣單胞菌病快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查的MPCR方法。研究中以粘附素基因(aha1)、溶血素基因(hly)和腸毒素基因(alt)三種主要毒力基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)合成特異性引物并通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了MPCR方法。該方法在12h內(nèi)即可從病料中或分離菌中檢測出一種或任何組合的氣單胞菌毒力基因，其特異性強(qiáng)，敏感度達(dá)102cfu·mL-1。　　再次，應(yīng)用MPCR

3、方法檢測安徽分離株攜帶毒力基因情況，確定其分子流行病學(xué)特征。研究中分別提取細(xì)菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行alt、hly和ahal毒力基因MPCR擴(kuò)增。表明alt基因廣泛存在于不同表型種氣單胞菌中，alt+ahal+hly+基因型是其主要毒力基因型。　　最后，選取具有代表性的6株氣單胞菌，對(duì)其毒力基因進(jìn)行克隆測序。研究中設(shè)計(jì)合成針對(duì)aha1、hly和alt基因完整開放閱讀框(ORF)的特異性引物，對(duì)毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與p