乙肝病毒通過(guò)下調(diào)TRIF蛋白導(dǎo)致的先天免疫逃逸.pdf

1、背景：
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的感染是全球位居前十的死因，已明確被認(rèn)為是肝硬化，原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的重要病因。根據(jù)2002年的世界腫瘤流行病學(xué)數(shù)據(jù)，當(dāng)年發(fā)現(xiàn)的原發(fā)性肝癌有54.4％可以歸咎于HBV的感染。目前以核苷類似物和α干擾素為主的治療效果不甚理想。肝細(xì)胞作為病毒感染的靶細(xì)胞，雖然不是通常意義上的專職免疫細(xì)胞，但是由于它是病毒生長(zhǎng)復(fù)制的場(chǎng)所，數(shù)量眾多，而且研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞本身也存在著先天免疫

2、通路和原始的免疫監(jiān)視機(jī)制，因而宿主細(xì)胞層面的先天免疫在抑制HBV中的作用也得到了重視，并被許多研究所證實(shí)。為了自身的生存，HBV發(fā)展出了相應(yīng)的策略來(lái)逃避免疫清除。因而，深入的研究HBV逃避宿主免疫的分子機(jī)制，有利于更好的理解乙肝病毒感染如何慢性化，并對(duì)其治療提供新的策略選擇，對(duì)從病因上更好的防控乙肝后肝硬化和肝癌的發(fā)生具有重要的意義。
　　目的：
　　肝細(xì)胞是乙型肝炎病毒感染的靶細(xì)胞，宿主細(xì)胞層面的對(duì)病毒的防御(intrac

3、ellular host defence)在抑制乙肝病毒中的作用得到越來(lái)越多的重視。目前的研究發(fā)現(xiàn)激活肝細(xì)胞內(nèi)的先天免疫機(jī)制能有效的抑制病毒。TRIF作為TLR3信號(hào)通路中重要的銜接蛋白，常常被感染的病毒(包括HAV和HCV)所劫持以發(fā)展免疫逃逸。本文將研究HBV的感染對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)。TRIF蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，初步的探索是哪個(gè)病毒蛋白成分經(jīng)何途徑的調(diào)節(jié)；同時(shí)探討了TRIF對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響并試圖闡述了相關(guān)的抗病毒分子機(jī)制。通過(guò)本

4、研究，意圖豐富對(duì)HBV逃避宿主細(xì)胞先天免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為開(kāi)發(fā)HBV的治療提供新的理論上的策略選擇。
　　方法：
　　1、在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV表達(dá)質(zhì)粒和空白質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞中，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV的肝癌細(xì)胞與親本細(xì)胞中，在以小RNA干擾技術(shù)沉默HBV表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞中，在13例HBV陰性的肝組織和12例HBV陽(yáng)性的肝組織中，應(yīng)用qRT-PCR與蛋白免疫印跡法分別在mRNA與蛋白水平檢測(cè)TRIF的表達(dá)。初步分析HBV對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)

5、TRIF蛋白的影響。
　　2、構(gòu)建HBV病毒蛋白X，Core，LHBs，Polymerase的表達(dá)質(zhì)粒，與空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，蛋白免疫印跡法檢測(cè)TRIF表達(dá)以鑒別是哪個(gè)病毒蛋白導(dǎo)致了TRIF的改變。以野生型HBV質(zhì)粒、X基因缺陷型HBVX-質(zhì)粒、HBVX-聯(lián)合X表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，以逐漸增量的X質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，以逐漸增量的X質(zhì)粒和恒量的TRIF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，蛋白免疫印跡法檢測(cè)TRIF表達(dá)進(jìn)一步明確X蛋白的作用。轉(zhuǎn)染

6、X質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞，予蛋白酶體抑制劑MG132處理后再檢測(cè)TRIF表達(dá)。以X質(zhì)粒和TRIF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，免疫共沉淀檢測(cè)X和TRIF是否存在相互作用。
　　3、向肝癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染TRIF質(zhì)粒和HBV表達(dá)質(zhì)粒，設(shè)置不表達(dá)TRIF的對(duì)照組，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg濃度；裂解培養(yǎng)細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒內(nèi)的HBV復(fù)制中間體DNA，以real-time PCR檢測(cè)；qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBc mRNA的水平

7、；蛋白免疫印跡法檢測(cè)病毒蛋白HBc表達(dá)。向HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞HepG2.2.15中同樣轉(zhuǎn)染TRIF質(zhì)粒和空白質(zhì)粒，同上觀察HBV的復(fù)制與表達(dá)。
　　4、在肝癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)TRIF蛋白，以雙熒光素酶報(bào)告基因法觀察NF-kB、ISRE的活化和IFN-β啟動(dòng)子的活化，以qRT-PCR檢測(cè)受它們調(diào)節(jié)的基因TNF-α、ISG15和IFN-β的mRNA改變。為了觀察NF-kB的活化在抑制HBV復(fù)制中的作用，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV的肝癌細(xì)胞中給

8、予NF-kB抑制劑BAY11-7082處理，real-time PCR法檢測(cè)HBV的表達(dá)與復(fù)制。在肝癌細(xì)胞中上調(diào)TRIF表達(dá)，通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞和細(xì)胞核的形態(tài)，檢測(cè)caspase-3/7的活性反映細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)果：
　　1、所有表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞和HBV陽(yáng)性的肝組織標(biāo)本中，TRIF蛋白水平的表達(dá)降低。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV的肝癌細(xì)胞與HBV陽(yáng)性的肝組織標(biāo)本中，TRIF的mRNA表達(dá)水平也明顯下降，但與之不同的是，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

9、HBV的肝癌細(xì)胞中，其mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化。以siRNA抑制穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞中HBV的表達(dá)后，TRIF蛋白增加，基因表達(dá)無(wú)明顯改變。
　　2、以之前所用的野生型含有129％病毒基因組長(zhǎng)度的HBV質(zhì)粒為模板，成功構(gòu)建病毒蛋白X，Core，LHBs，Polymerase的表達(dá)質(zhì)粒。我們發(fā)現(xiàn)正是X蛋白導(dǎo)致了肝癌細(xì)胞內(nèi)TRIF蛋白表達(dá)的下降，并且這種抑制與X蛋白的表達(dá)呈劑量依賴關(guān)系。在野生型HBV質(zhì)粒、X基因缺陷型HBVX-質(zhì)粒、HBV

10、X-聯(lián)合X表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，再次證實(shí)了X蛋白對(duì)TRIF的下調(diào)。蛋白酶體抑制劑MG132的處理抑制了X蛋白誘導(dǎo)的TRIF表達(dá)下調(diào)。在X質(zhì)粒和TRIF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞中，免疫共沉淀未能發(fā)現(xiàn)X和TRIF的相互作用。
　　3、在表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TRIF蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg水平降低，肝細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒中的HBV復(fù)制中間體DNA減少，細(xì)胞內(nèi)HBcmRNA的水平下降；病毒蛋白HBc表達(dá)下降。
　

11、　4、在肝癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)TRIF，促進(jìn)了NF-kB、ISRE和IFN-β啟動(dòng)子的活化，受它們調(diào)節(jié)的基因TNF-α、ISG15和IFN-β的mRNA水平上升。阻斷NF-kB的活化后能明顯提高肝細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制和表達(dá)。肝癌細(xì)胞中上調(diào)的TRIF表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　1、HBV能下調(diào)TRIF蛋白的表達(dá).但在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型和代表了HBV慢性持續(xù)感染狀態(tài)的穩(wěn)轉(zhuǎn)HBV的肝癌細(xì)胞和慢性乙肝組織中，TRIF基因水平的表達(dá)顯示