構(gòu)建神經(jīng)生長因子基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的實驗研究.pdf

1、目的： 1.優(yōu)化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rat bone marrow-derived mesenchymal stemcells，rBMSCs)體外分離、培養(yǎng)、純化、擴增的方法。 2.將構(gòu)建成功的含有神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)基因的慢病毒載體感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，并觀察神經(jīng)生長因子在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達，為下一步在動物體內(nèi)進行基因治療提供基礎(chǔ)。 方法： 1.全骨

2、髓貼壁培養(yǎng)法行rBMSCs提取、分離、培養(yǎng)，用低糖DMEM+10％胎牛血清作為細胞培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察rBMSCs形態(tài)及生長，通過傳代純化和擴增，至第二代以后每次傳代時取部分細胞分裝凍存。 2.取第三代rBMSCs流式細胞學(xué)鑒定其表面CD標(biāo)記并進行成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定。 3.以含有NGF基因的慢病毒載體和含有GFP的慢病毒空載體(作為實驗對照)，感染靶細胞rBMSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察感染后的rBMSCs中GF

3、P表達情況。 4.以慢病毒空載體做對照，取感染后的rBMSCs培養(yǎng)液上清采用ELISA檢測rBMSCs中NGF蛋白的表達。 5.以慢病毒空載體做對照，取感染后的rBMSCs提取RNA后行實時熒光定量PCR檢測rBMSCs NGF基因mRNA水平的表達。 結(jié)果： 1.全骨髓培養(yǎng)法采集和擴增的rBMSCs生長良好并穩(wěn)定傳代，細胞培養(yǎng)至第3代后呈現(xiàn)比較均一的長梭形、成纖維狀形態(tài)。流式細胞儀檢測擴增后的rBMSC

4、s表面抗原特征，結(jié)果表明rBMSCs強表達干細胞表面標(biāo)記CD44、CD90、CD106，而弱表達甚至不表達造血干細胞特異抗原CD34、CD45等，并且能向成骨、成脂誘導(dǎo)分化，證實為非造血干細胞的另一類干細胞。 2.在感染入含神經(jīng)生長因子基因的慢病毒載體的rBMSCs中，應(yīng)用實時熒光定量PCR可檢測到NGF前體基因的mRNA，其培養(yǎng)液上清應(yīng)用ELISA方法可檢測到NGF蛋白。 結(jié)論： 1.通過全骨髓培養(yǎng)法貼壁篩選成