視黃酸對(duì)豚鼠近視眼視網(wǎng)膜色素上皮—脈絡(luò)膜復(fù)合體作用的相關(guān)研究.pdf

1、第一章：RA和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在豚鼠離焦型近視眼視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜復(fù)合體中的表達(dá)
　　目的:通過建立豚鼠離焦型近視模型，觀察視黃酸(RA)、緊密連接蛋白ZO-1和Occludin在視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)-脈絡(luò)膜復(fù)合體中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，探討豚鼠近視眼中RA、ZO-1、Occludin在近視眼中可能的調(diào)控作用。
　　方法:取3周齡三色豚鼠（體重約150-180g）30只（雌雄不限），隨機(jī)分為A組:正常

2、組(n=15)，豚鼠雙眼均不佩戴鏡片;B組:離焦組(n=15)，豚鼠右眼均佩戴-6.00D的凹透鏡作為實(shí)驗(yàn)眼，左眼均不佩戴鏡片作為自身對(duì)照眼。分別于實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)第3天、第7天、第14天均對(duì)各組豚鼠進(jìn)行屈光度、眼軸的檢測(cè)，并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜復(fù)合體組織用高效液相色譜分析儀檢測(cè)其RA的含量，用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA含量，Western blot技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白

3、ZO-1、Occludin的蛋白含量，同時(shí)利用免疫熒光技術(shù)觀察其表達(dá)部位。
　　結(jié)果:1、屈光度和眼軸變化:隨著離焦時(shí)間的延長(zhǎng)，A組豚鼠雙眼屈光度均呈正視化方向發(fā)展，眼軸呈正常生長(zhǎng)發(fā)育速度增長(zhǎng)，各時(shí)間點(diǎn)雙眼屈光度、眼軸長(zhǎng)度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。B組實(shí)驗(yàn)眼呈明顯近視漂移，離焦第14天時(shí)誘導(dǎo)出相對(duì)近視約4.70D，實(shí)驗(yàn)眼與自身對(duì)照眼屈光度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)眼相對(duì)自身對(duì)照眼眼軸增長(zhǎng)速度加快，離

4、焦第14天時(shí)實(shí)驗(yàn)眼（8.18±0.09mm）與自身對(duì)照眼（7.68±0.06mm）眼軸長(zhǎng)度比較差異最大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各時(shí)間點(diǎn)正常組與自身對(duì)照眼比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、視黃酸表達(dá)變化:視黃酸在豚鼠實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜復(fù)合體上的表達(dá)隨離焦時(shí)間延長(zhǎng)而上調(diào)，實(shí)驗(yàn)眼在離焦第14天表達(dá)最高，表達(dá)量為137.85±1.02ng/100mg，其與自身對(duì)照眼（12.67±0.40ng/100mg）

5、比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各時(shí)間點(diǎn)正常組與自身對(duì)照眼比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、緊密連接蛋白表達(dá)變化:緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在豚鼠實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜復(fù)合體中的mRNA和蛋白表達(dá)均隨離焦時(shí)間延長(zhǎng)而上調(diào)，在離焦第14天表達(dá)最高，其與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各時(shí)間點(diǎn)正常組與自身對(duì)照眼比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。免疫熒光檢測(cè)顯示ZO-1、Occl

6、udin主要表達(dá)于RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體組織的RPE層，其熒光表達(dá)結(jié)果變化趨勢(shì)與Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果相符。
　　結(jié)論:通過給豚鼠佩戴-6.00D凹透鏡可以成功建立離焦型近視模型;視黃酸在豚鼠離焦型近視的發(fā)展過程中表達(dá)上調(diào);緊密連接蛋白ZO-1、Occludin隨離焦時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)上調(diào)，可能參與了近視的形成和發(fā)展。
　　第二章：RA受體拮抗劑LE540對(duì)豚鼠離焦型近視眼視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜

7、復(fù)合體中視黃酸和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的影響
　　目的:觀察LE540對(duì)豚鼠離焦型近視眼視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜復(fù)合體中視黃酸以及緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達(dá)的影響，探討視黃酸與緊密連接蛋白ZO-1、Occludin之間可能的調(diào)控關(guān)系。
　　方法:取3周齡三色豚鼠（體重約150-180g）90只（雌雄不限），隨機(jī)分為A組:正常組(n=15):豚鼠雙眼均不佩戴鏡片，且不予任何藥物干預(yù);B組:離焦組(

8、n=15)，豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透鏡，左眼均不佩戴鏡片，雙眼均不予任何藥物干預(yù);C組:陰性對(duì)照組(n=15)，豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透鏡，同時(shí)予玻璃體腔內(nèi)注射PBS5μL;D組:藥物干預(yù)組(n=45)，豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透鏡，同時(shí)予玻璃體腔內(nèi)注射不同濃度RA受體拮抗劑LE540，根據(jù)LE540注射的不同濃度將D組分為D1組:10μM注射組(n=15); D2組:50μM注射組(n=15); D3組:100μM注射

9、組(n=15)。以上各組左眼均為自身對(duì)照眼。在實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)第3天、第7天、第14天對(duì)以上各組豚鼠進(jìn)行屈光度、眼軸的檢測(cè)，并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜復(fù)合體用高效液相色譜分析儀檢測(cè)其RA的含量，在D1、D2、D3組中根據(jù)視網(wǎng)膜色素上皮復(fù)合體中RA含量的變化及對(duì)屈光度和眼軸長(zhǎng)度的影響，選擇藥物干預(yù)后對(duì)豚鼠離焦型近視影響最明顯的組別作為D組，運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)A、B、C、D組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin

10、的mRNA含量，Western blot技術(shù)檢測(cè)各組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的蛋白含量，同時(shí)利用免疫熒光技術(shù)觀察其表達(dá)部位及表達(dá)強(qiáng)度。
　　結(jié)果:1、屈光度和眼軸變化:A組豚鼠雙眼屈光度均呈正視化發(fā)展，雙眼眼軸呈正常生長(zhǎng)發(fā)育速度增長(zhǎng)，各時(shí)間點(diǎn)雙眼屈光度、眼軸長(zhǎng)度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。B組豚鼠右眼屈光度呈明顯近視漂移，右眼相對(duì)左眼眼軸增長(zhǎng)速度加快，實(shí)驗(yàn)第7天、第14天右眼分別與正常組以及左眼屈光度及眼

11、軸比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);C組雙眼屈光度及眼軸變化與B組一致，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);D組隨離焦時(shí)間的延長(zhǎng)，豚鼠各組右眼屈光度近視漂移、眼軸增長(zhǎng)趨勢(shì)隨LE540注射濃度的不同均被不同程度抑制，其中在D2(50μM)組抑制趨勢(shì)最為明顯。而各時(shí)間點(diǎn)自身對(duì)照眼屈光度和眼軸與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、LE540對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜復(fù)合體中RA表達(dá)的影響:A組豚鼠雙眼RA表達(dá)在各時(shí)

12、間點(diǎn)均無明顯差異，比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。B組豚鼠右眼RA隨離焦時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)上調(diào)。C組豚鼠右眼RA表達(dá)變化與B組表達(dá)變化趨勢(shì)一致，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。D組豚鼠右眼玻璃體腔注射不同濃度RA受體拮抗劑LE540后，各組RA表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)隨LE540注射濃度的不同均受到不同程度抑制，其中D2組抑制作用最明顯。各時(shí)間點(diǎn)自身對(duì)照眼視黃酸表達(dá)與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、LE540對(duì)視網(wǎng)膜色

13、素上皮-脈絡(luò)膜復(fù)合體中緊密連接蛋白的影響:A組豚鼠雙眼緊密連接蛋白ZO-1、Occludin隨離焦時(shí)間延長(zhǎng)無明顯變化。B組豚鼠右眼緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA和蛋白表達(dá)隨離焦時(shí)間延長(zhǎng)而上調(diào)，左眼自身對(duì)照眼表達(dá)均無明顯變化。C組豚鼠雙眼緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達(dá)變化與B組相近。D組豚鼠右眼玻璃體腔注射不同濃度RA受體拮抗劑LE540后，各組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)趨