人纖溶酶原K5抑制肝癌血管生成和腫瘤生長的作用及結構基礎.pdf

1、中山大學博士學位論文人纖溶酶原K5抑制肝癌血管生成和腫瘤生長的作用及結構基礎姓名：楊霞申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：高國全朱振宇20060501中文摘要K5的實驗研究主要集中在血管增生性眼病動物模型上，而有關K5在腫瘤治療方面的研究卻少有報道：(2)K5完整多肽已獲美國專利和中國專利保護，無自主知識產權；(3)相對于K5功能和潛在臨床應用價值的研究，其抑制血管增生的活性和Kringle結構域中二硫鍵的位置、數(shù)量所

2、決定的內外環(huán)結構的關系尚不明確。因此，本研究擬從以下三方面解決上述問題：(1)運用基因工程方法獲得人纖溶酶原K5純化蛋白，在新生血管豐富的肝癌細胞同種種植小鼠和異種種植裸鼠模型上觀察K5抑制肝癌血管生成和腫瘤生長的效應并初步探討其作用的分子機制；(2)對K5基因進行改造，獲得比K5分子量更小、性質更穩(wěn)定的K5突變體I(K5mutantl，K5mutl)基因工程純化蛋白。觀察其抑制肝癌血管生成和腫瘤生長的作用及其效果；(3)根據(jù)K5蛋白的

3、結構特征和二硫鍵分布特點，構建并表達K5的兩個缺失突變體蛋白。在體外細胞模型和體內肝癌皮下種植瘤模型上分析其抗血管增生活性，從而判斷維持K5生物活性所需的最小氨基酸序列和基本空間結構，明確K5kringle結構域和二硫鍵與其功能的關系。主要研究內容和結果如下：第1部分K5缺失突變體I、Ⅲ的構建及表達純化L成功構建K5缺失突變體I、Ⅲ。通過PCR獲得的目的基因片段經瓊脂糖凝膠電泳分析，與預期產物大小相符做理論計算K5為292bp，K5mu

4、tl為258bp，K5mut3為180bp)。測序結果表明目的基因片段與pET22b()連接無誤，閱讀框架正確，K5突變體構建成功。2獲得高純度可溶性的突變體蛋白。鑒定正確的重組體轉化到BL21(DE3)宿主菌中，經IPTG低溫誘導，可表達出可溶性重組蛋白。誘導表達的細菌經溶菌酶充分消化后，離心取上清，用Ni2HisBindResin親和柱純化，獲得高純度可溶性蛋白。用凝膠成像系統(tǒng)(GENEGENIUS公司產品)對凝膠進行灰度掃描，結果