克羅恩病和腸結(jié)核患者單個(gè)核細(xì)胞miRNA的差異表達(dá)及臨床意義.pdf

1、炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)，近年來在我國發(fā)病率逐年增多，其診斷和治療方面依然存在許多難點(diǎn)。由于在我國腸結(jié)核（Intestinal tuberculosis，ITB）的發(fā)病率仍然很高，部分CD與ITB患者在臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡及病理學(xué)改變方面極為相似，雖然目前國內(nèi)外已有多種檢查方法來區(qū)分

2、兩者，但鑒別診斷依然十分困難。
　　結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）是目前診斷活動性結(jié)核感染最有價(jià)值的一種檢查方法，通過結(jié)核桿菌特異性抗原CFP-10、ESAT-6的刺激后，患者外周血中被致敏的單個(gè)核細(xì)胞特異性地釋放γ-干擾素，然后通過固像免疫顯色形成沉淀斑點(diǎn)，從而判斷是否存在隱性或現(xiàn)癥感染結(jié)核。在目前臨床應(yīng)用中，國外報(bào)道中T-SPOT.TB檢測的敏感性和特異性能達(dá)到95％以上，因此正逐漸得以推廣。T-SPOT.TB技

3、術(shù)是一個(gè)已經(jīng)證實(shí)為很好的診斷結(jié)核的方法，但該技術(shù)在鑒別CD和ITB上仍無更多相關(guān)研究。我們首先探索了該技術(shù)在鑒別CD和ITB中的價(jià)值，結(jié)果提示T-SPOT.TB可很好區(qū)分明顯活動性CD和ITB，但對活動程度較輕和緩解期的CD和ITB鑒別仍有困難。目前研究發(fā)現(xiàn)，microRNA（miRNA）在CD與UC中有作為分子標(biāo)志鑒別診斷的作用，而且已經(jīng)證實(shí)不同的miRNA在多種腫瘤中可作為分子標(biāo)志物用以鑒別不同部位腫瘤，IBD組織中也有相對特異性的

4、miRNA表達(dá)，是否在CD和ITB患者單個(gè)核細(xì)胞中存在不同的miRNA呢？經(jīng)特異性結(jié)核抗原刺激后的CD和ITB患者單個(gè)核細(xì)胞中是否存在miRNA表達(dá)的差異呢？目前少見通過對比CD與ITB患者miRNA表達(dá)差異進(jìn)行鑒別診斷的研究報(bào)道。我們通過對CD和ITB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞受到結(jié)核特異性抗原CFP-10、ESAT-6刺激后所產(chǎn)生miRNA進(jìn)行miRNA芯片表達(dá)譜分析，對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)一步在CD和ITB患者腸道手術(shù)病理組織中進(jìn)行驗(yàn)

5、證，以期在兩種病變組織中找到有鑒別診斷價(jià)值的特異性miRNA，為鑒別診斷這兩種疾病提供新的分子標(biāo)志。
　　目的：
　　1．應(yīng)用T-SPOT.TB方法研究該方法在鑒別診斷CD與ITB中的價(jià)值。
　　2．比較CD與ITB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)特異性結(jié)核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后的miRNA表達(dá)譜。
　　3．應(yīng)用Real-time PCR方法在CD和ITB患者腸道病變組織中驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA。
　

6、　方法：
　　1．采集CD與ITB及腸外結(jié)核患者的外周血標(biāo)本共126例，進(jìn)行T-SPOT.TB檢測；
　　2．以正常自愿者作為對照，采集3例正常自愿者、3例活動期CD與3例活動期ITB患者外周血分離提取單個(gè)核細(xì)胞，分別給予特異性結(jié)核抗原CFP-10以及ESAT-6刺激后培養(yǎng)；將兩組培養(yǎng)后的細(xì)胞以正常自愿者組作為對照，進(jìn)行miRNA芯片分析篩選；
　　3．應(yīng)用生物信息學(xué)進(jìn)行分析miRNA表達(dá)譜，找出表達(dá)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的

7、差異miRNA；
　　4．對表達(dá)差異的miRNA分別在5例正常人、5例CD和5例ITB腸組織標(biāo)本中進(jìn)行Real－timePCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1．確診CD患者15例[11.9％（15/126）]，ITB患者14例[11.1％（14/126）]，腸外結(jié)核患者40例[31.7％（40/126）]。CD、ITB、腸外結(jié)核、其他疾病患者T-SPOT.TB陽性率分別為6.7％（1/15）、85.7％（12/14）、70％

8、（28/40）、0％（0/57），各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。CD與ITB患者的T-SPOT.TB陽性率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=70.58，P=0.001）。T-SPOT.TB檢測CD敏感性和特異性分別為93.3％（14/15）和87.5％（14/16），檢測ITB時(shí)則分別為85.7％（12/14）和93.3％（14/15），CD的陰性預(yù)測值[87.5％（14/16）]高于ITB的陰性預(yù)測值[12.5％（2/16）]。以

9、上結(jié)果提示T-SPOT.TB診斷TB的敏感性與特異性高，其有助于鑒別診斷CD和ITB。
　　2．提取3例正常人、確診的3例活動期CD和3例活動期ITB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分為三組，其中3例正常人、確診的3例活動期CD患者均進(jìn)行T-SPOT.TB檢測均為陰性，3例活動期ITB患者進(jìn)行T-SPOT.TB檢測均為強(qiáng)陽性。三組外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)特異性結(jié)核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后進(jìn)行miRNA芯片分析篩選，miRNA表達(dá)譜結(jié)果發(fā)

10、現(xiàn)CD與ITB對比，上調(diào)的miRNA有12個(gè)，下調(diào)的miRNA有10個(gè)，經(jīng)抗原刺激后的CD與ITB對比，上調(diào)的miRNA有9個(gè)，下調(diào)miRNA的有1個(gè)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析靶基因與差異miRNA的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，上調(diào)與下調(diào)的miRNA分別有7個(gè)。最后綜合分析后得到差異最顯著的miRNA有5個(gè)，分別是miR-125b、miR-31、miR-19b、miR-939、miR-144。
　　3．Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果提示：miR-31、mi

11、R-19b、miR-939、miR-144在CD與ITB中對比并無明顯差異，而miR-125b在CD和ITB組織的表達(dá)中有明顯差異，在正常對照中,miR-125b均值=1.001，在ITB中miR-125b均值=1.161，CD中miR-125b均值=0.679，miR-125b在ITB中表達(dá)量水平明顯高于CD組織，P<0.01，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著意義。
　　結(jié)論：
　　1．T-SPOT.TB是活動性CD和ITB有效的鑒別診