克羅恩病和腸結核患者單個核細胞miRNA的差異表達及臨床意義.pdf

1、炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)，近年來在我國發(fā)病率逐年增多，其診斷和治療方面依然存在許多難點。由于在我國腸結核（Intestinal tuberculosis，ITB）的發(fā)病率仍然很高，部分CD與ITB患者在臨床表現、內鏡及病理學改變方面極為相似，雖然目前國內外已有多種檢查方法來區(qū)分

2、兩者，但鑒別診斷依然十分困難。
　　結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是目前診斷活動性結核感染最有價值的一種檢查方法，通過結核桿菌特異性抗原CFP-10、ESAT-6的刺激后，患者外周血中被致敏的單個核細胞特異性地釋放γ-干擾素，然后通過固像免疫顯色形成沉淀斑點，從而判斷是否存在隱性或現癥感染結核。在目前臨床應用中，國外報道中T-SPOT.TB檢測的敏感性和特異性能達到95％以上，因此正逐漸得以推廣。T-SPOT.TB技

3、術是一個已經證實為很好的診斷結核的方法，但該技術在鑒別CD和ITB上仍無更多相關研究。我們首先探索了該技術在鑒別CD和ITB中的價值，結果提示T-SPOT.TB可很好區(qū)分明顯活動性CD和ITB，但對活動程度較輕和緩解期的CD和ITB鑒別仍有困難。目前研究發(fā)現，microRNA（miRNA）在CD與UC中有作為分子標志鑒別診斷的作用，而且已經證實不同的miRNA在多種腫瘤中可作為分子標志物用以鑒別不同部位腫瘤，IBD組織中也有相對特異性的

4、miRNA表達，是否在CD和ITB患者單個核細胞中存在不同的miRNA呢？經特異性結核抗原刺激后的CD和ITB患者單個核細胞中是否存在miRNA表達的差異呢？目前少見通過對比CD與ITB患者miRNA表達差異進行鑒別診斷的研究報道。我們通過對CD和ITB患者外周血單個核細胞受到結核特異性抗原CFP-10、ESAT-6刺激后所產生miRNA進行miRNA芯片表達譜分析，對差異表達的miRNA進一步在CD和ITB患者腸道手術病理組織中進行驗

5、證，以期在兩種病變組織中找到有鑒別診斷價值的特異性miRNA，為鑒別診斷這兩種疾病提供新的分子標志。
　　目的：
　　1．應用T-SPOT.TB方法研究該方法在鑒別診斷CD與ITB中的價值。
　　2．比較CD與ITB患者外周血單個核細胞經特異性結核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后的miRNA表達譜。
　　3．應用Real-time PCR方法在CD和ITB患者腸道病變組織中驗證差異表達的miRNA。
　

6、　方法：
　　1．采集CD與ITB及腸外結核患者的外周血標本共126例，進行T-SPOT.TB檢測；
　　2．以正常自愿者作為對照，采集3例正常自愿者、3例活動期CD與3例活動期ITB患者外周血分離提取單個核細胞，分別給予特異性結核抗原CFP-10以及ESAT-6刺激后培養(yǎng)；將兩組培養(yǎng)后的細胞以正常自愿者組作為對照，進行miRNA芯片分析篩選；
　　3．應用生物信息學進行分析miRNA表達譜，找出表達有明顯統(tǒng)計學意義的

7、差異miRNA；
　　4．對表達差異的miRNA分別在5例正常人、5例CD和5例ITB腸組織標本中進行Real－timePCR驗證。
　　結果：
　　1．確診CD患者15例[11.9％（15/126）]，ITB患者14例[11.1％（14/126）]，腸外結核患者40例[31.7％（40/126）]。CD、ITB、腸外結核、其他疾病患者T-SPOT.TB陽性率分別為6.7％（1/15）、85.7％（12/14）、70％

8、（28/40）、0％（0/57），各組間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。CD與ITB患者的T-SPOT.TB陽性率間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=70.58，P=0.001）。T-SPOT.TB檢測CD敏感性和特異性分別為93.3％（14/15）和87.5％（14/16），檢測ITB時則分別為85.7％（12/14）和93.3％（14/15），CD的陰性預測值[87.5％（14/16）]高于ITB的陰性預測值[12.5％（2/16）]。以

9、上結果提示T-SPOT.TB診斷TB的敏感性與特異性高，其有助于鑒別診斷CD和ITB。
　　2．提取3例正常人、確診的3例活動期CD和3例活動期ITB患者外周血單個核細胞分為三組，其中3例正常人、確診的3例活動期CD患者均進行T-SPOT.TB檢測均為陰性，3例活動期ITB患者進行T-SPOT.TB檢測均為強陽性。三組外周血單個核細胞經特異性結核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后進行miRNA芯片分析篩選，miRNA表達譜結果發(fā)

10、現CD與ITB對比，上調的miRNA有12個，下調的miRNA有10個，經抗原刺激后的CD與ITB對比，上調的miRNA有9個，下調miRNA的有1個，調控網絡分析靶基因與差異miRNA的關系發(fā)現，上調與下調的miRNA分別有7個。最后綜合分析后得到差異最顯著的miRNA有5個，分別是miR-125b、miR-31、miR-19b、miR-939、miR-144。
　　3．Real-time PCR驗證結果提示：miR-31、mi

11、R-19b、miR-939、miR-144在CD與ITB中對比并無明顯差異，而miR-125b在CD和ITB組織的表達中有明顯差異，在正常對照中,miR-125b均值=1.001，在ITB中miR-125b均值=1.161，CD中miR-125b均值=0.679，miR-125b在ITB中表達量水平明顯高于CD組織，P<0.01，經統(tǒng)計學分析有顯著意義。
　　結論：
　　1．T-SPOT.TB是活動性CD和ITB有效的鑒別診