克羅恩病和腸結核患者單個核細胞miRNA的差異表達及臨床意義.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD),近年來在我國發(fā)病率逐年增多,其診斷和治療方面依然存在許多難點。由于在我國腸結核(Intestinal tuberculosis,ITB)的發(fā)病率仍然很高,部分CD與ITB患者在臨床表現、內鏡及病理學改變方面極為相似,雖然目前國內外已有多種檢查方法來區(qū)分

2、兩者,但鑒別診斷依然十分困難。
  結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)是目前診斷活動性結核感染最有價值的一種檢查方法,通過結核桿菌特異性抗原CFP-10、ESAT-6的刺激后,患者外周血中被致敏的單個核細胞特異性地釋放γ-干擾素,然后通過固像免疫顯色形成沉淀斑點,從而判斷是否存在隱性或現癥感染結核。在目前臨床應用中,國外報道中T-SPOT.TB檢測的敏感性和特異性能達到95%以上,因此正逐漸得以推廣。T-SPOT.TB技

3、術是一個已經證實為很好的診斷結核的方法,但該技術在鑒別CD和ITB上仍無更多相關研究。我們首先探索了該技術在鑒別CD和ITB中的價值,結果提示T-SPOT.TB可很好區(qū)分明顯活動性CD和ITB,但對活動程度較輕和緩解期的CD和ITB鑒別仍有困難。目前研究發(fā)現,microRNA(miRNA)在CD與UC中有作為分子標志鑒別診斷的作用,而且已經證實不同的miRNA在多種腫瘤中可作為分子標志物用以鑒別不同部位腫瘤,IBD組織中也有相對特異性的

4、miRNA表達,是否在CD和ITB患者單個核細胞中存在不同的miRNA呢?經特異性結核抗原刺激后的CD和ITB患者單個核細胞中是否存在miRNA表達的差異呢?目前少見通過對比CD與ITB患者miRNA表達差異進行鑒別診斷的研究報道。我們通過對CD和ITB患者外周血單個核細胞受到結核特異性抗原CFP-10、ESAT-6刺激后所產生miRNA進行miRNA芯片表達譜分析,對差異表達的miRNA進一步在CD和ITB患者腸道手術病理組織中進行驗

5、證,以期在兩種病變組織中找到有鑒別診斷價值的特異性miRNA,為鑒別診斷這兩種疾病提供新的分子標志。
  目的:
  1.應用T-SPOT.TB方法研究該方法在鑒別診斷CD與ITB中的價值。
  2.比較CD與ITB患者外周血單個核細胞經特異性結核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后的miRNA表達譜。
  3.應用Real-time PCR方法在CD和ITB患者腸道病變組織中驗證差異表達的miRNA。
 

6、 方法:
  1.采集CD與ITB及腸外結核患者的外周血標本共126例,進行T-SPOT.TB檢測;
  2.以正常自愿者作為對照,采集3例正常自愿者、3例活動期CD與3例活動期ITB患者外周血分離提取單個核細胞,分別給予特異性結核抗原CFP-10以及ESAT-6刺激后培養(yǎng);將兩組培養(yǎng)后的細胞以正常自愿者組作為對照,進行miRNA芯片分析篩選;
  3.應用生物信息學進行分析miRNA表達譜,找出表達有明顯統(tǒng)計學意義的

7、差異miRNA;
  4.對表達差異的miRNA分別在5例正常人、5例CD和5例ITB腸組織標本中進行Real-timePCR驗證。
  結果:
  1.確診CD患者15例[11.9%(15/126)],ITB患者14例[11.1%(14/126)],腸外結核患者40例[31.7%(40/126)]。CD、ITB、腸外結核、其他疾病患者T-SPOT.TB陽性率分別為6.7%(1/15)、85.7%(12/14)、70%

8、(28/40)、0%(0/57),各組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。CD與ITB患者的T-SPOT.TB陽性率間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=70.58,P=0.001)。T-SPOT.TB檢測CD敏感性和特異性分別為93.3%(14/15)和87.5%(14/16),檢測ITB時則分別為85.7%(12/14)和93.3%(14/15),CD的陰性預測值[87.5%(14/16)]高于ITB的陰性預測值[12.5%(2/16)]。以

9、上結果提示T-SPOT.TB診斷TB的敏感性與特異性高,其有助于鑒別診斷CD和ITB。
  2.提取3例正常人、確診的3例活動期CD和3例活動期ITB患者外周血單個核細胞分為三組,其中3例正常人、確診的3例活動期CD患者均進行T-SPOT.TB檢測均為陰性,3例活動期ITB患者進行T-SPOT.TB檢測均為強陽性。三組外周血單個核細胞經特異性結核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后進行miRNA芯片分析篩選,miRNA表達譜結果發(fā)

10、現CD與ITB對比,上調的miRNA有12個,下調的miRNA有10個,經抗原刺激后的CD與ITB對比,上調的miRNA有9個,下調miRNA的有1個,調控網絡分析靶基因與差異miRNA的關系發(fā)現,上調與下調的miRNA分別有7個。最后綜合分析后得到差異最顯著的miRNA有5個,分別是miR-125b、miR-31、miR-19b、miR-939、miR-144。
  3.Real-time PCR驗證結果提示:miR-31、mi

11、R-19b、miR-939、miR-144在CD與ITB中對比并無明顯差異,而miR-125b在CD和ITB組織的表達中有明顯差異,在正常對照中,miR-125b均值=1.001,在ITB中miR-125b均值=1.161,CD中miR-125b均值=0.679,miR-125b在ITB中表達量水平明顯高于CD組織,P<0.01,經統(tǒng)計學分析有顯著意義。
  結論:
  1.T-SPOT.TB是活動性CD和ITB有效的鑒別診

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