HSP70抑制LPS所致細胞因子表達的分子機制研究.pdf

1、本研究從調控炎癥介質基因表達的細胞內信號轉導通路，探討熱休克反應(heat shock response，HSR)以及HSP70抑制LPS所致細胞因子表達的機制。 經采用RT-PCR、ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌脂多糖(LPS)可誘導RAW264.7小鼠巨噬細胞產生大量TNF-α，IL-1β和IL-15等細胞因子。當細胞經受熱休克反應(42.5℃1h，恢復12h)后再進行LPS刺激，則LPS誘導的細胞因子表達受到抑制。在此基礎上

2、采用過表達HSP70的RAW264.7細胞進行實驗，發(fā)現(xiàn)HSP70同樣抑制了LPS誘導的細胞因子表達。 鑒于細胞內信號轉導通路在調控炎癥介質基因表達中的作用，本實驗采用磷酸化抗體檢測MAPK信號通路的活化，分析了HSR以及HSP70對LPS所致MAPK信號通路活化的影響。Westem blot結果顯示，HSR以及HSP70自身均不影響MAPK的活化(磷酸化)。在LPS刺激30min后，HSR組以及HSP70過表達組中的JNK、E

3、RK、p38的活化(磷酸化)程度與非HSR正常細胞組或轉空載體細胞組比較均無明顯區(qū)別。EMSA結果顯示，HSR以及HSP70不影響LPS刺激所致的MAPK下游轉錄因子AP-1的DNA結合活性。據(jù)此我們認為，HSR以及HSP70不影響LPS所致的MAPK信號通路活化，其抑制LPS所致細胞因子表達的機制可能涉及其他因素。 由于NF-κB／IκB信號轉導通路的活化在LPS所致炎癥反應的發(fā)生中具有重要作用，我們進一步分析了HSP70過表

4、達對LPS所致NF-κB信號通路活化的影響。通過免疫熒光、免疫細胞化學及Westem blot等技術檢測NF-κB(p65)的核移位，我們發(fā)現(xiàn)HSP70高表達明顯抑制了LPS刺激60 min所致的NF-κB(p65)核移位及LPS刺激20 min所致的IκB降解。EMSA結果顯示，在LPS處理60 min，熱休克反應以及HSP70高表達明顯抑制LPS所致的NF-κB的DNA結合活性。 由于IκBa的降解涉及IκBa的磷酸化，而I

5、κBα的磷酸化是由IκB的激酶IKK以及相應的磷酸酯酶相互影響、協(xié)同作用的結果。因此，我們進一步分析了HSR以及HSP70對細胞內磷酸酯酶活性的影響。在熱休克恢復8h、12h、24h后，細胞內磷酸酯酶活性明顯增高。在LPS刺激30min或1h后，HSR組細胞內的磷酸酯酶活性仍高于非HSR對照組細胞。同樣，過表達的HSP70也增高了細胞內的磷酸酯酶活性。 在此基礎上，我們采用磷酸酯酶抑制劑okadaic acid(OA)分析細胞內

6、磷酸酯酶活性受抑制時，HSR和HSP70對LPS所致NF-κB信號通路活化以及細胞因子產生的影響。實驗結果顯示，經歷熱休克反應的細胞以及HSP70過表達細胞受OA處理后再經LPS刺激，其表達、釋放的IL-1水平與單純LPS刺激細胞所產生的IL-1無明顯區(qū)別。免疫熒光顯示，OA處理后，熱休克反應以及HSP70高表達均不能明顯抑制LPS所致的NF-κB(p65)的核移位。 另外，我們通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，高表達的IISP70與IκB激