1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文白細(xì)胞介素7基因治療卵巢癌的體外研究姓名：程蓓申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：謝幸葉大風(fēng)2001.5.1塑堊查蘭堡—蘭二_』生—垡—蘭二2王—————————————一RTPCR技術(shù)從人脾組織中獲取IL7cDNA基因，與克隆載體PMDl8一T連接構(gòu)建PMDl8，TIL7重組體，用BamHJ及HindlII雙酶切pBKCMV和PMDl8I“IL7，將酶切后的IL7和pBKCMV連接起來構(gòu)建hlL7原核、真核雙
2、相表達(dá)重組體DBKCMVIL7，進(jìn)一步用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測pBKCMVIL7在原核細(xì)胞DH5a中的表達(dá)。結(jié)果：成功獲取人IL7cDNA基因，經(jīng)測序證實(shí)對碼，序列無誤；PMDl8T1L7和口BKCMVIL7重組體經(jīng)PCR和酶切鑒定證實(shí)IL7已克隆進(jìn)表達(dá)載體；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，行全菌SDS—PAGE，結(jié)果見重組體轉(zhuǎn)化菌株在45KD處有增強(qiáng)條帶。結(jié)論：從人脾組織成功構(gòu)建了人IL7克隆重組體PMDl8一TIL一7：利用上述重組體，成功構(gòu)建了人
3、IL7原核、真核雙重高效表達(dá)重組體pBKCMV—IL7，其可在大腸桿菌DH5口中，經(jīng)1PTG誘導(dǎo)，產(chǎn)生45KD左右的融合蛋白。r—≯一。第二部分、穩(wěn)定表達(dá)IL7的SKOV3細(xì)胞株的建立／廠／目的：將【L7cDNA基因轉(zhuǎn)染SKOV3，觀察IL7基因轉(zhuǎn)染前后腫瘤細(xì)胞IL7mRNA及蛋白的表達(dá)，建立穩(wěn)定表達(dá)IL7的SKOV3細(xì)胞株。方法：用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pBKCMVIL7基因轉(zhuǎn)染SKOV3，行G4】8篩選，并用R丁PCR、WesternBlo
4、t及ELISA法測定轉(zhuǎn)染后pBKCMVIL7重組體在SKOV3細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)。同時以轉(zhuǎn)染空載體pBKCMV為對照。結(jié)果：1換用選擇性培養(yǎng)基后，大部分轉(zhuǎn)染pBKCMV1L7及pBKCMV的SKOV3細(xì)胞(分別用SKOV3IL一7和SKOV3Neo表示)在1周后死亡，少數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)生長增殖，SKOV3IL7細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中生長16周仍有抗性，而未轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞則在l周后完全裂解死亡。2基因轉(zhuǎn)染后812周，SKOV3IL
5、7、SKOV3Neo及SKOV3細(xì)胞抽提的總RNA，經(jīng)DNase消化后，直接PCR，未出現(xiàn)IL7(639bP)及pBKCMV(226bp)的條帶，而以IL7為引物的RTPCR，SKOV3IL7細(xì)胞出現(xiàn)639bp的陽性條帶，SKOV3Neo及SKOV3細(xì)胞未見陽性條帶。以pBKCMV為引物的RTPCR，SKOV3IL7細(xì)胞出現(xiàn)865bp的陽性條帶，SKOV3Neo出現(xiàn)226bp的陽性條帶，SKOV3細(xì)胞未見陽性條帶。3基因轉(zhuǎn)染后lO周，S