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文檔簡介
1、目的:建立熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase ChainReaction FQ-PCR)溶解曲線分析技術,初步對正常人外周血及大腸癌患者外周血、癌周組織中T細胞抗原受體(T Cell Receptor,TCR)β鏈各家族互補決定區(qū)3(Complementarity Determining Region3,CDR3)譜系進行熒光PCR定量分析,并采用溶解曲線法分析TCRβ鏈各家族的單克
2、隆、寡克隆、多克隆增生(CDR3譜系漂移)情況。下一步擬對單克隆或寡克隆增生的T淋巴細胞β鏈的CDR3區(qū)進行測序,分析大腸癌患者機體抗腫瘤T細胞的TCR分子特征,為大腸癌患者T細胞應答機制、個性化治療提供理論基礎。 方法:1、標本采集:(1)采集4例正常人外周抗凝靜脈血5ml;(2)采集9例大腸癌患者術前外周靜脈血5ml及其中7例手術患者癌周圍組織(30 μg以上);2、按密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(Peripheral
3、 Blood Mononuclear Cell,PBMC),提取PBMC及組織樣品中總RNA,逆轉錄成cDNA:3、以各研究對象的cDNA為樣本,以人TRBV26個家族基因設計上游引物,TRBC基因設計共同的下游引物,熒光定量PCR擴增TCRβ鏈各家族的CDR3區(qū),進行相對定量分析,同時對各PCR產物做溶解曲線圖,分析各家族CDR3譜型。 結論:(1)正常人PBMC中26個TRBV CDR3的熒光定量PCR溶解曲線譜型圖呈多峰圖
4、,無單峰、寡峰、偏峰及極低水平或缺失等現(xiàn)象出現(xiàn),提示機體在沒有腫瘤、感染、自身免疫疾病的情況下,TCR B鏈CDR3譜型圖呈高斯分布;(2)在大腸癌患者PBMC及其組織樣本中腫瘤浸潤性T淋巴細胞(Tumour Infiltrating Lymphocyte,TIL)的TRBV CDR3熒光定量PCR溶解曲線譜型圖中,顯示TCRβ鏈各家族出現(xiàn)數(shù)目不等的單峰、寡峰、偏峰及極低水平或缺失等現(xiàn)象,提示其可能是在腫瘤相關抗原等決定簇的驅使下而發(fā)生
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