GABA支路調控柑橘果實檸檬酸代謝的機理研究.pdf

1、有機酸是柑橘果實風味品質的重要組成成分，其含量高低與果實衰老進程和鮮果貨架期長短緊密相關。檸檬酸是柑橘果實中最重要的有機酸，在柑橘采后貯藏過程中，有機酸會隨著呼吸和能量代謝逐漸被消耗，導致果實風味品質下降，失去商品價值。不同果實中有機酸含量的高低受遺傳、環(huán)境和栽培技術等因素共同影響;細胞內有機酸水平受其合成、分解、轉運和液泡貯藏綜合調控。前人關于有機酸代謝的研究大多集中在TCA循環(huán)關鍵酶的調控。近年來越來越多的研究者開始關注有機酸降解和

2、液泡貯藏對其含量的影響。γ-氨基丁酸(GABA)支路是檸檬酸降解的主要途徑之一，同時GABA代謝的最終產物琥珀酸又能回補到TCA循環(huán)，為該循環(huán)提供所需的碳骨架。因而細胞質中合成的GABA能否進入線粒體進一步代謝不僅影響檸檬酸的降解，同時還可影響TCA循環(huán)的底物供應。線粒體GABA透性酶(GABP)控制著GABA向線粒體的轉運，是連接GABA代謝和TCA循環(huán)的閥門，但有關其對檸檬酸代謝的具體調控機制尚不清楚，以及其對GABA的轉運引起的線

3、粒體內外具體的生理生化反應也缺乏系統(tǒng)的研究。本研究以不同來源的高酸和低酸柑橘果實為材料，研究GABA代謝支路對貯藏期檸檬酸含量的影響，并以柑橘GABP為切入點，對其調控檸檬酸代謝的機制展開深入研究，主要結果如下:
　　1.外源GABA處理可以顯著提高采后貯藏期間夏橙(Citrus sinensis Osbeck‘Valencia’)和紐荷爾（Citrus sinensis Osbeck‘Newhall’）果實中檸檬酸的含量。實驗結

4、果表明，外源GABA處理柑橘果實，可誘導內源GABA積累。基因表達分析顯示，處理可抑制GABA上游谷氨酸脫羧酶(GAD)的表達，同時在貯藏初期還降低了GABP的表達，從而抑制檸檬酸的降解。此外，與檸檬酸代謝相關的氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、纈氨酸以及脯氨酸在處理的果實中也出現不同程度的積累。GABA處理提高了果實中抗氧化酶如POD的酶活性和ATP的含量;同時顯著降低了貯藏期果實的腐爛率，提高了果實的貯藏性能。與處理夏橙不同的是，G

5、ABA處理加速了紐荷爾果實果皮顏色由黃轉紅，提高了果實的貯藏品質。GABA作為GRAS(Generally Recognized As Safe)類化合物，本研究為柑橘采后生產提供了一種高效且安全的采后處理方法，用以提高果實的貯藏品質和性能。
　　2.GABA支路基因的表達活性參與決定HB(Citrus grandis Osbeck‘HiradoBuntan’)×Fairchild（Citrus reticulata×Citrus

6、 grandis‘Fairchild’）雜交群體高酸和低酸果實中的酸水平。通過連續(xù)三年對雜交群體果實進行品質分析，發(fā)現可滴定酸(TA)含量穩(wěn)定地表現出高于親本的特征。選取雜交群體中穩(wěn)定表現出最高酸和最低酸的果實進行貯藏實驗。結果表明，在貯藏過程中TA含量下降明顯，而可溶性固形物(TSS)含量變化不大。高酸果實中即使TA含量逐漸下降，卻仍能維持顯著高于低酸果實的特征。初生代謝物含量檢測發(fā)現雜交群體TA含量的超親特征主要歸因于檸檬酸水平，而

7、與蘋果酸無關;除了天冬氨酸和天冬酰胺之外，與檸檬酸代謝密切相關的其他氨基酸沒有表現出和檸檬酸含量類似的變化特征。值得注意的是，即使這些代謝物的含量在果實貯藏過程中會出現波動變化，卻不改變其在高酸和低酸果實中的相對高低，說明果實發(fā)育成熟過程中積累的代謝物含量水平決定了其在貯藏過程中的含量高低。檸檬酸代謝相關基因的表達分析表明大部分GABA代謝支路基因以及順烏頭酸酶(Aco)的表達在高酸果實中顯著低于低酸果實，是高酸果實維持高酸含量的主要原

8、因。對果實的呼吸測定分析發(fā)現高酸果實的呼吸速率比低酸果實低，說明高酸果實中通過呼吸消耗的有機酸少。果實失水率測定結果表明在貯藏過程中失水率呈現逐漸上升的趨勢，并且與TA含量呈現顯著負相關關系，即高酸果實的失水率比低酸果實低，說明有機酸與水分之間存在密切聯(lián)系。本研究從遺傳背景對貯藏柑橘果實有機酸含量的影響著手，突出了GABA代謝支路活性對酸積累的決定作用。
　　3.柑橘GABA轉運蛋白基因（CgGABP）通過調控檸檬酸代謝相關基因的

9、表達參與調控檸檬酸代謝，且轉錄因子CgbHLH13和CgBBX32能夠通過負調控GABP的表達參與調控檸檬酸水平。以檸檬酸含量差異較大的普通高酸柑橘品種HB柚（Citrus grandis Osbeck‘Hirado Buntan’）和低酸品種無酸柚（Citrus gr andis Osbeck）為材料，同樣發(fā)現在高酸HB柚果實中GABA代謝支路所有基因的表達都顯著低于無酸柚，說明GABA代謝支路基因同樣參與決定HB柚和無酸柚果實中的酸

10、水平。因而以CgGABP基因為切入點對其進行了功能分析及對檸檬酸代謝的調控研究。聚類分析表明CgGABP蛋白屬于氨基酸/多胺/有機陽離子(APC)超家族中雙向作用的氨基酸轉運蛋白(BAT)亞家族成員;拓撲結構分析表明CgGABP與已報道的AtGABP的結構非常相似，擁有12個跨膜結構域，并有很多保守的氨基酸殘基。亞細胞定位結果顯示CgGABP定位在線粒體中，屬于線粒體GABA轉運蛋白。
　　將CgGABP超量表達轉化番茄，成功獲得

11、轉基因番茄植株。初生代謝產物分析發(fā)現，轉基因番茄果實中檸檬酸含量明顯增加。并且轉基因番茄果實表現出高含量的谷氨酸、谷氨酰胺、棕櫚酸和硬脂酸，以及低含量的脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、琥珀酸及蔗糖。進一步對檸檬酸代謝相關基因的表達分析顯示超量表達CgGABP可以抑制番茄內源SlAco3a和SlAco3b的表達，誘導檸檬酸合酶(SlCS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(SlPEPC)基因的表達，因而促進了檸檬酸的積累。
　　酵

12、母單雜交文庫篩選獲得與CgGABP啟動子互作的上游調控因子，并對其蛋白結構進行生物信息學分析，發(fā)現其中一個為bHLH家族成員，命名為CgbHLH13;另一個為BBX家族成員，命名為CgBBX32。亞細胞定位實驗進一步確定轉錄因子CgbHLH13和CgBBX32定位于細胞核中，符合轉錄因子定位特征。酵母點對點實驗進一步證實了轉錄因子CgbHLH13和CgBBX32與CgGABP啟動子存在互作。煙草雙熒光素酶分析發(fā)現轉錄因子CgbHLH13

13、和CgBBX32負調控CgGABP的表達。超量表達轉錄因子CgbHLH13和CgBBX32轉化柑橘愈傷組織，得到2個基因的轉基因愈傷系。轉錄水平分析表明超量表達愈傷組織中GABP的表達顯著低于野生型，符合負調控特征。同時檸檬酸含量在轉基因愈傷中顯著低于野生型，并且脯氨酸、鳥氨酸、GABA、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸以及蔗糖含量在轉基因愈傷組織中顯著高于野生型，而谷氨酸、棕櫚酸和硬脂酸的含量顯著低于野生型，這些結果正好與超量表達CgGABP轉

14、基因番茄獲得的結果相反，符合GABP被抑制的表型。另外轉基因愈傷組織中Aco的上調表達及PEPC和CS的下調表達同樣能夠解釋檸檬酸積累的下降。此外，超量表達CgGABP激活了GABA代謝支路，而谷氨酸分解代謝主要轉向GABA代謝;相反，超量表達轉錄抑制子阻滯了GABA代謝，谷氨酸代謝主要向脯氨酸、鳥氨酸等其他路徑進行分解代謝。本研究中，通過超量表達CgGABP基因以及超量表達CgGABP負調控因子抑制GABP表達的方法，充分證實了GAB