MnSOD基因轉(zhuǎn)染及丹參酮對(duì)胃癌細(xì)胞生長的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、第一部分,不同分化胃癌細(xì)胞株內(nèi)超氧化物歧化酶的表達(dá)及內(nèi)源性活性氧水平.目的:檢測(cè)正常胃粘膜及MKN-28、SGC7901、BGC823、HGC-27四種不同分化的胃癌細(xì)胞株內(nèi)錳型超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA的表達(dá),評(píng)價(jià)MnSOD轉(zhuǎn)錄水平與腫瘤細(xì)胞分化程度、胞內(nèi)活性氧(ROS)水平及增殖活性的相關(guān)性.方法:利用酶底物催化方法測(cè)定四種胃癌細(xì)胞株的堿性磷酸酶(ALP)及乳酸脫氫酶(LDH)活力.RT—PCR方法檢測(cè)正常胃粘膜組織及MK

2、N-28、SGC7901、BGC823、HGC-27四株高、中、低、未分化胃癌細(xì)胞株內(nèi)的MnSOD mRNA的表達(dá).利用2'7'-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)熒光染色方法檢測(cè)不同分化胃癌細(xì)胞株的胞內(nèi)ROS水平.四唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定不同分化胃癌細(xì)胞株的增殖活性并繪制生長曲線.第二部分,MnSOD基因轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞增殖的影響.目的:觀察改變胞內(nèi)MnSOD基因表達(dá)水平對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞增殖的影響.方法:采用電

3、穿孔方法將反義和正義MnSOD cDNA真核表達(dá)載體pHβA-SOD(-)/pH-βA-SOD(+)轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞,400mg/LG418篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆并用RT-PCR及Western雜交法鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng).用pHβA空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對(duì)照.放射免疫法檢測(cè)正義、反義及空載SGC7901胃癌細(xì)胞株內(nèi)的銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD,SOD1)蛋白含量.分別用直接細(xì)胞計(jì)數(shù)法、四唑藍(lán)(MTT)比色法、平皿克隆形成率試驗(yàn)及裸鼠移植瘤

4、模型測(cè)定三組細(xì)胞在體外、體內(nèi)的增殖活性.第三部分,MnSOD調(diào)控SGC7901胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制.目的:進(jìn)一步研究MnSOD高、低表達(dá)調(diào)控SGC7901胃癌細(xì)胞增殖的分子生物學(xué)機(jī)制.方法:采用DCF—DA熒光染色法檢測(cè)MnSOD-7901、MnSOD-AS7901及Vector—7901三組細(xì)胞的胞內(nèi)ROS水平;透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變;流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期;免疫組化法檢測(cè)P53、Bcl-2、Ki67、C-erbB2

5、的蛋白表達(dá).RT—PCR檢測(cè)三組細(xì)胞的P53mRNA表達(dá).第四部分,丹參酮ⅡA誘導(dǎo)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡的研究.目的:觀察抗氧化劑丹參酮ⅡA(TanⅡA)在體外對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞的作用,并對(duì)其分子機(jī)制作初步研究.方法:分別采用1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L的不同濃度梯度的TanⅡA干預(yù)SGC7901胃癌細(xì)胞24、48、72小時(shí)后,用MTT比色法繪制腫瘤細(xì)胞生長曲

6、線.采用1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L的不同濃度梯度的TanⅡA干預(yù)SGC7901胃癌細(xì)胞24小時(shí),或同樣采用10.0mg/L的TanⅡA干預(yù)0、12、24、36、48小時(shí),應(yīng)用碘化丙叮(PI)及Annexin V雙重染色法,通過流式細(xì)胞儀觀察不同濃度梯度及不同時(shí)間梯度干預(yù)下的SGC7901細(xì)胞凋亡率及壞死亡.用透射電鏡直接觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并拍攝照片記錄.用RT—PCR檢