Waddles小鼠遺傳性小腦性共濟失調(diào)的分子機制的研究.pdf

1、目的：探討引起Waddles(Wdl)小鼠遺傳性小腦性共濟失調(diào)的分子機制。 方法：正常(+/+)和雜合子(+/Wdl)小鼠均購自美國突變小鼠群體資源庫(JAX)，在美國田納西大學健康科學中心動物房飼養(yǎng)和繁殖。F2代為正常(+/+)、雜合子(+/Wdl)及Wdl(Wdl/Wdl)小鼠，我們采用成年(2-4)個月的Wdl小鼠30只和同等數(shù)量同胎生的正常小鼠進行運動試驗以確認動物模型。我們應(yīng)用高通量溫度梯度毛細管電泳技術(shù)，對Wdl小鼠

2、第4號染色體Wdl位點基因進行PCR及RT-PCR擴增和檢查，并用基因測序和RT-PCR的方法來證實突變基因的存在。為了確定突變的Car8基因是否影響其轉(zhuǎn)錄和翻譯，我們對從Wdl小鼠和正常小鼠提取的mRNA進行Northern雜交，使用親和法提純的家兔的CAR8蛋白多克隆抗體進行Westernblot分析，應(yīng)用免疫組化的方法研究Wdl小鼠CAR8蛋白是否缺乏。為了研究調(diào)節(jié)Car8基因及靶基因表達的分子機制，我們應(yīng)用了基因芯片微點陣(Mi

3、croarray)分析。 結(jié)果：1.Wdl小鼠和正常同胎生小鼠運動功能分析，足跡分析觀察到，Wdl小鼠步距寬，為共濟失調(diào)步態(tài)。與同胎生的正常小鼠比較，前腿及后腿均步距寬度增加(P＜0.05)，而大步行走及前后步距長度無明顯異常。旋轉(zhuǎn)試驗Wdl小鼠表現(xiàn)差，在每一個轉(zhuǎn)速下，能耐受的時間變短(P＜0.05)。 2.我們發(fā)現(xiàn)Wdl小鼠的Car8基因中的第7個外顯子擴增產(chǎn)物的分子量比正常小鼠的擴增產(chǎn)物小。通過不同條件下的PCR和使

4、用正常和Wdl小鼠Car8基因cDNA檢查，我們證實了上述結(jié)果。對Car8基因的第7個外顯子測序發(fā)現(xiàn)，在Wdl小鼠中有19個核苷酸缺失。 3.我們使用mRNA進行Northern雜交，發(fā)現(xiàn)Wdl小鼠的Car8基因轉(zhuǎn)錄明顯降低，而+/Wdl小鼠Car8基因的轉(zhuǎn)錄水平介于正常和Wdl小鼠之間。Wdl小鼠展示了一個相當?shù)退降腃ar8基因表達和略低水平的IP3R1基因表達，說明Car8基因突變使該基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，亦可使IP3R1基

5、因表達下降。我們使用親和法提純的家兔的CAR8蛋白多克隆抗體進行Westernblot分析，在正常和+/Wdl小鼠的小腦細胞中存在CAR8蛋白，表達量相似，而在Wdl小鼠的小腦細胞中則不能探查到CAR8蛋白的存在。檢測結(jié)果表明，Car8基因的突變對于IP3R1翻譯水平的影響較小。在正常、雜合子及Wdl小鼠，Westernblot分析IP3R1蛋白無明顯差別。說明Car8基因突變使該基因的翻譯水平下降而對IP3R1基因翻譯水平無明顯影響。

6、我們的免疫組化分析也表明，正常小鼠的CAR8和IP3R1蛋白在小腦細胞中的位置相同，而在Wdl小鼠的小腦細胞中，IP3R1蛋白的位置與正常小鼠相同，但檢測不到CAR8蛋白。 4.我們應(yīng)用了基因芯片微點陣分析發(fā)現(xiàn)Car8突變基因的表達異?？梢鹋c鈣平衡有關(guān)的其它基因的表達發(fā)生改變。 結(jié)論：1.Wdl小鼠確為一種具有共濟失調(diào)和肌張力障礙而無中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理形態(tài)改變的動物模型。 2.Wdl小鼠Car8基因的第7個外顯子

7、的19個核苷酸的缺失，改變了正常CAR8蛋白的最后38個氨基酸的組成，突變蛋白較正常蛋白減少了17個氨基酸。缺失的19個核苷酸可引起移碼突變，使三聯(lián)體密碼開放閱讀框發(fā)生改變，不僅使翻譯后的肽鏈中氨基酸序列發(fā)生改變，而且也導致肽鏈中的大片段缺失。因此，Wdl小鼠產(chǎn)生的CAR8蛋白比正常小鼠的CAR8蛋白少17個氨基酸，最后的38個氨基酸變成21個氨基酸。 3.Wdl小鼠Car8基因突變改變其基因表達，使轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)及蛋白質(zhì)翻譯障礙

8、。由于CAR8蛋白對于IP3R1的調(diào)節(jié)作用，CAR8蛋白缺乏會改變細胞的Car8-IP3R1-Ca2+級聯(lián)反應(yīng)，而這種級聯(lián)反應(yīng)的異常，又可以引起小腦細胞功能障礙，進而可引起小鼠的共濟失調(diào)和肌張力異常 4.Car8突變基因的表達異常可引起與鈣平衡有關(guān)的其它基因的表達改變。鈣動力異常引起小腦浦肯野細胞生理及病理生理學的異?？赡苁枪矟д{(diào)的主要原因。 以上研究亦為探查基因序列異常和運動功能障礙之間的關(guān)系開創(chuàng)了新的視角。