旋覆花內(nèi)酯衍生物對結(jié)腸癌細胞株CT26增殖和凋亡的影響.pdf

1、結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤。結(jié)腸癌的治療目前主要是采用手術(shù)根治切除治療,輔以放化療預防腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。以往的研究發(fā)現(xiàn),旋覆花的一種倍半萜類化合物——旋覆花內(nèi)酯(ABL)具有影響腫瘤細胞的細胞周期,誘導腫瘤細胞凋亡的作用,但其穩(wěn)定性和溶解性都不太好。本實驗用的是旋覆花內(nèi)酯衍生物(ABL-N),在體外以不同濃度的ABL-N處理結(jié)腸癌細胞株CT26,觀察其對細胞增殖和凋亡的影響。
　　 目的:
　　 (1)觀察ABL-N對

2、CT26細胞增殖能力的影響。
　　 (2)觀察ABL-N對CT26細胞周期的影響。
　　 (3)觀察ABL-N對CT26凋亡的影響,并進一步探討其誘導凋亡的可能的機制。
　　 方法:
　　 (1)MTT法檢測ABL-N對CT26細胞增殖的影響:以不同濃度ABL-N處理CT26細胞24 h,進行MTT法檢測,根據(jù)實驗組和對照組平均OD值計算各實驗組的細胞增殖抑制率。
　　 (2)平板克隆形成實驗進一

3、步檢測ABL-N對CT26增殖能力的影響:實驗組以不同濃度ABL-N處理已貼壁的CT26細胞24 h,再以新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)9 d,對照組在同樣條件下以溶劑培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時間,染色,計數(shù)各組克隆數(shù),計算各組克隆形成率。
　　 (3)流式細胞術(shù)檢測對照組和實驗組的細胞凋亡率及周期分布:實驗組以ABL-N處理CT26細胞24 h,對照組在同樣條件下以溶劑培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集細胞,進行流式細胞術(shù)檢測。
　　 (4)透射電鏡

4、技術(shù)檢測CT26細胞經(jīng)ABL-N處理后細胞凋亡的形態(tài)學改變:實驗組以ABL-N處理CT26細胞24 h,對照組在同樣條件下以溶劑培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集細胞,進行透射電鏡檢測。
　　 (5)細胞免疫熒光技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡檢測CT26細胞中Caspase-3和Caspase-9基因的表達:實驗組以不同濃度ABL-N處理CT26細胞24 h,對照組在同樣條件下以溶劑培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,進行免疫熒光染色,固定,封閉,一抗4℃孵育過

5、夜,二抗室溫孵育2 h,激光共聚焦顯微鏡掃描。比較各組細胞的平均熒光強度,進而比較各組細胞Caspase-3和Caspase-9基因表達的差異。
　　 結(jié)果:
　　 (1)MTT結(jié)果:5、10、20和40mg/L ABL-N實驗組的抑制率分別為1.6％、16.9％、53.4％和92.1％,5mg/L ABL-N組OD值雖比對照組小,但與對照組比較并無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),10、20和40mg/L ABL-N均可明顯

6、抑制CT26細胞的增殖(P＜0.05或P＜0.01),其對結(jié)腸癌細胞株CT26增殖的抑制作用具有濃度依賴性。
　　 (2)平板克隆形成實驗結(jié)果:5、10和20mg/L的ABL-N作用24 h后繼續(xù)培養(yǎng)9 d的CT26細胞的克隆形成率分別為(44.7±3.8)％、(28.6±2.5)％和(4.6±1.4)％,40mg/L.ABL-N作用后的CT26細胞沒有克隆形成,與對照組克隆形成率(53.4±1.9)％相比,5mg/L即可明顯抑

7、制CT26細胞的克隆形成(P＜0.05),而10、20和40mg/L的抑制作用更強(P＜0.01),ABL-N抑制CT26細胞克隆形成作用亦呈明顯的濃度依賴性。
　　 (3)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果:20mg/L ABL-N處理24 h的CT26細胞周期分布為G1期87.5％,S期11.8％,細胞凋亡率為55.8％,與對照組結(jié)果G1期67.9％,S期29.6％,細胞凋亡率4.14％比較,顯示ABL-N可以通過阻滯CT26的細胞周期,影

8、響細胞的生長,并且具有誘導細胞凋亡的作用。
　　 (4)透射電鏡觀察細胞凋亡形態(tài):20mg/L ABL-N處理24 h的CT26細胞在透射電鏡下可見細胞質(zhì)電子密度增加,可見許多空泡,胞質(zhì)中線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少,部分核膜向內(nèi)反折呈銳角突起或呈球形膨出,核固縮,大部分核膜缺失,核內(nèi)容物外排到細胞質(zhì)中,核染色質(zhì)高度濃縮,形成凋亡細胞特有的“半月”狀。
　　 (5)免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡檢測凋亡相關(guān)基因Caspas

9、e-3和Caspase-9基因表達的結(jié)果:20和40mg/L ABL-N組細胞質(zhì)中的Caspase-3和Caspase-9基因表達均明顯比對照組高(P＜0.01),且40mg/LABL-N比20mg/L ABL-N作用更強(P＜0.01),即.ABL-N濃度依賴性地誘導CT26細胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的表達。
　　 結(jié)論:
　　 (1)ABL-N對CT26細胞的增殖有抑制作用,且其抑制作用呈