采用組織工程技術(shù)重建外周神經(jīng).pdf

1、長(zhǎng)距離的外周神經(jīng)缺損，目前臨床常用自體腓腸神經(jīng)作游離移植或多股移植神經(jīng)行電纜式縫合。但是這些方法受限于自身外周神經(jīng)的供源不足及供體神經(jīng)供區(qū)的功能喪失甚至壞死。同時(shí)，重建組織或器官移植后的功能全面恢復(fù)也必須依賴(lài)于外周神經(jīng)的支配與調(diào)節(jié)。本研究課題在利用已有的去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架移植入體內(nèi)2個(gè)月后軸突的成功再生及神經(jīng)功能部分恢復(fù)的兔模型基礎(chǔ)上，研究將受體自身Schwanncell粘附于同種異體去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架后植入受體體內(nèi)，通過(guò)對(duì)重建坐骨神經(jīng)

2、不同時(shí)間點(diǎn)的軸突生長(zhǎng)水平，神經(jīng)傳導(dǎo)速度以及重建神經(jīng)支配區(qū)的痛覺(jué)、溫度覺(jué)、肌力等組織學(xué)，電生理和神經(jīng)行為的檢測(cè)與評(píng)估，闡明SchwannceU在加快植入重建坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)中的重要性，為外周神經(jīng)損傷后植入重建神經(jīng)以及組織和器官移植后功能全面恢復(fù)的可行性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 第一部分同種異體兔去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架模型的建立 方法：從供體兔切取5cm長(zhǎng)坐骨神經(jīng)后，將坐骨神經(jīng)浸入4℃蒸溜水中2448小時(shí)，然后放入0．05％n

3、ypsin溶液中，在37℃環(huán)境下，以250rpm速度振蕩處理24小時(shí)，再將神經(jīng)移入1％niton和0．1％AmmoniumHydroxide混合液中，在4℃環(huán)境下振蕩72小時(shí)后，反復(fù)用蒸溜水洗滌，再將神經(jīng)放入1×PBs液中振蕩8小時(shí)，然后將神經(jīng)放入一20℃冷凍柜中冷凍20．30分鐘，取出神經(jīng)后凍干24小時(shí)，用2％PLGA涂于神經(jīng)表面并密封處理神經(jīng)，再用乙烯氧化物冷氣消毒，包裝、貯藏至使用。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)多步驟的去細(xì)胞過(guò)程，并通過(guò)組

4、織學(xué)、免疫組化及免疫熒光染色證實(shí)：已基本溶解了坐骨神經(jīng)內(nèi)所有細(xì)胞，神經(jīng)支架仍保持原有完整的鞘和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。但是去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架的機(jī)械性能相當(dāng)脆弱，故用2％PLGA涂于去細(xì)胞神經(jīng)支架表面以恢復(fù)去細(xì)胞神經(jīng)支架的柔韌性，同時(shí)電鏡證實(shí)：2％PLGA處理后的去細(xì)胞神經(jīng)支架表面仍然有大量多孔狀結(jié)構(gòu)的存在，不妨礙細(xì)胞的粘附和移入。 結(jié)論：用0．05％nypsin，1％niton和0．1％AmmoniumHydBOXide及凍干技術(shù)可以成功地制

5、備出同種異體去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架，同時(shí)用2％PLGA涂于去細(xì)胞神經(jīng)支架表面，可以恢復(fù)去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架的柔韌性，又不影響原有的多孔、疏松的精細(xì)超微狀結(jié)構(gòu)，為手術(shù)成功創(chuàng)造了最理想的條件。 第二部分受體兔自體SchwannceU的收集、體外培養(yǎng)和擴(kuò)增方法的建立 方法：無(wú)菌切取坐骨神經(jīng)。放入消化液中在37℃水浴中振蕩消化30分鐘。吸去消化液后，用10％FBs／DMEM液反復(fù)清洗3次，再用吸管反復(fù)吹打組織，過(guò)濾收集濾液，離心(15

6、00轉(zhuǎn)／min×10min)后，棄去上清液，用1m10％FBS/DMEM液混懸沉淀細(xì)胞并種植于用PDL處理過(guò)的培養(yǎng)皿中，靜置24小時(shí)后，加入Ara-c繼續(xù)培養(yǎng)48—72小時(shí)，洗滌去除Ara-c后加入SchwannCCIl培養(yǎng)液(10％FBS／DMEM竹hNGF十5mMForskolin)繼續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞生長(zhǎng)成單層時(shí)進(jìn)行傳代。 結(jié)果：10天后，光鏡下發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)的原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)出突起，胞體較小，大多呈雙極，邊界清晰，折光度強(qiáng)，細(xì)

7、胞排列整齊，單層培養(yǎng)，無(wú)重疊生長(zhǎng)一接觸抑制；免疫細(xì)胞化學(xué)(抗S100)染色提示：培養(yǎng)的原代細(xì)胞s100呈陽(yáng)性反應(yīng)；免疫印跡法證實(shí)：培養(yǎng)的原代細(xì)胞中有Schwanncell標(biāo)記蛋白S100存在。 結(jié)論：用消化液，schwanncell培養(yǎng)液和成纖維細(xì)胞抑制液可以成功地在體外分離、收集，培養(yǎng)和增殖Schwanncelk但由于神經(jīng)細(xì)胞增殖速度較一般細(xì)胞慢，且傳代次數(shù)少，故難以在有限的傳代次數(shù)中(平均傳代15次)得到足夠量的Schwar

8、mcell用于坐骨神經(jīng)重建。 第三部分用粘附受體自身Schwanncell的同種畀體去細(xì)胞神經(jīng)支架重建坐骨神經(jīng) 方法：術(shù)前24小時(shí)測(cè)定5cm長(zhǎng)坐骨神經(jīng)支架體積(n=30)并浸泡在4℃、1×PBS溶液中。術(shù)前20分鐘，將Schwanncell粘附到去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架上(n=20)。麻醉滿(mǎn)意后，在無(wú)菌操作下切除受體兔左側(cè)5cm長(zhǎng)坐骨神經(jīng)后，用9-0可吸收縫線(xiàn)將粘附受體自身Schwarmcell的去細(xì)胞坐骨神經(jīng)支架(5cm長(zhǎng))

9、無(wú)張力地端端吻合于受體兔正常坐骨神經(jīng)近、遠(yuǎn)兩端，吻合處用mNGF浸潤(rùn)后縫合傷口。受體兔右側(cè)坐骨神經(jīng)作正常對(duì)照組(n=30)，單純移植去細(xì)胞神經(jīng)支架(n=10)作陰性對(duì)照組。 結(jié)果：移植術(shù)后6個(gè)月，單純移植去細(xì)胞神經(jīng)支架，移植粘附schwanncell的去細(xì)胞神經(jīng)支架與正常對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)： 1、單純移植去細(xì)胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細(xì)胞神經(jīng)支架的軸突數(shù)量分別為8900±1060和12000±980，與正

10、常對(duì)照組6800±740統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，均有高度顯著性差異(P<0．01)，而移植不同去細(xì)胞支架之間的軸突數(shù)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，也有高度顯著性差異(P<0．01)。 2、單純移植去細(xì)胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細(xì)胞神經(jīng)支架的神經(jīng)傳導(dǎo)速度分別為31．7±5．92m／s和47．22±4．89m／s，與正常對(duì)照組49．6±3．24m／s統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，前者有高度顯著性差異(P<0．01)，后者無(wú)顯著性差異(P>0．05)。

11、 3、單純移植去細(xì)胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細(xì)胞神經(jīng)支架的肌力分別為175±8．6g和196±5．6g，與正常對(duì)照組200±6．8g統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，前者有高度顯著性差異(P<0．01)，后者無(wú)顯著性差異(P>0．05)。 4、單純移植去細(xì)胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細(xì)胞神經(jīng)支架的溫度覺(jué)分別為67±5．1℃和66±3．8℃，與正常對(duì)照組65±2．7℃統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，均無(wú)顯著性差異(P>0．05)。

12、 5、單純移植去細(xì)胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細(xì)胞神經(jīng)支架的痛覺(jué)分別為97．8±54％和984±3．8％，與正常對(duì)照組100±2％統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，均無(wú)顯著性差異(P>0．05)。 結(jié)論： 1、移植術(shù)后6個(gè)月，單純移植去細(xì)胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細(xì)胞神經(jīng)支架的軸突生長(zhǎng)水平均較正常對(duì)照組高，有利于重建坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)；而移植粘附Schwanncell的去細(xì)胞神經(jīng)支架更有利于坐骨神經(jīng)