人卵泡發(fā)育過程中卵泡液蛋白質組學研究.pdf

1、近年來，隨著分子生物學的飛速發(fā)展，許多研究表明卵母細胞成熟與蛋白質合成、磷酸化狀態(tài)的改變密不可分。已證實與卵子發(fā)育和成熟相關的調控物質包括StAR(steroidogenic acute regulatory protein)、減數(shù)分裂促進因子MPF、成熟刺激因子(MPF)、絲裂原激活蛋白激酶家族(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、cAMP/蛋白激酶A(cAMP/PKA)等等，但仍有許多未知蛋白和已知蛋白參與調節(jié)的具體過程尚不清楚，需要

2、進一步研究。探索卵母細胞成熟機制成為女性生殖領域的研究熱點。蛋白質組學能夠識別鑒定細胞、組織或機體的全部蛋白質，提供了一組蛋白質的功能及其模式的信息，能夠同時反映細胞內部的遺傳特性和外界因素的影響的結果。因此深入研究卵母細胞發(fā)育成熟的機制，客觀上需要在蛋白質組的水平進行進一步的探索。蛋白質雙向凝膠電泳．質譜技術的日趨成熟以及SELDI-TOF-MS技術的出現(xiàn)使蛋白質組學研究飛速發(fā)展，因為它從能夠從整體水平上揭示可能參與人類疾病發(fā)生、基因

3、調控、組織發(fā)生和發(fā)育等等蛋白分子調控機制。本研究采用SELDI-TOF-MS以及2-DE兩種技術，立足于整體，在蛋白質組水平上直接研究卵母細胞發(fā)育成熟的機制。 目的: 1．應用SELDI-TOF-MS技術，建立人成熟卵泡液及竇卵泡液的蛋白質表達指紋圖譜，尋找在卵泡生長發(fā)育及卵母細胞成熟過程中起關鍵作用的小分子蛋白質。 2．應用雙向凝膠電泳．質譜技術，建立人成熟卵泡液及竇卵泡液的蛋白質譜，篩選鑒定在卵泡生長發(fā)育及卵

4、母細胞成熟過程中起關鍵作用的大分子蛋白質。 3．建立未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)體系，研究探討篩選鑒定得到的卵母細胞成熟相關蛋白在卵母細胞成熟過程中的作用。 方法: 1．采用SELDI-TOF-MS技術和WCX-2蛋白芯片(弱陽離子交換蛋白質芯片)檢測48例人成熟卵泡液、21例竇卵泡液中的蛋白質組分變化，PBSII-C型蛋白質芯片閱讀機自動讀取數(shù)據(jù)，獲得的結果采用Ciphergen公司的Biomarker，wizard

5、和Biomarker Patterns System軟件進行分析。 2．采用雙向凝膠電泳．質譜技術檢測48例人成熟卵泡液、21例竇卵泡液中的蛋白質組分變化，比較兩組的蛋白表達差異，并對差異蛋白質點進行質譜鑒定。 3．以昆明白小鼠未成熟卵母細胞為研究對象，在體外培養(yǎng)體系中加入不同濃度的轉鐵蛋白/載脂蛋白E(篩選鑒定得到的卵母細胞成熟相關蛋白)，觀察其對卵母細胞減數(shù)分裂恢復、核成熟以及體外成熟的卵母細胞的受精率的影響。

6、 結果: 1．利用SELDI-TOF-MS技術通過WCX2芯片初步建立了人卵泡發(fā)育成熟過程中的蛋白質指紋圖譜，共捕捉到53個蛋白質峰(單電荷峰)，進行成熟卵泡液與竇卵泡液的成組數(shù)據(jù)均數(shù)比較t檢驗，31個蛋白質峰在兩組卵泡液中均低表達，18個蛋白質峰高表達，差異無顯著性；4個蛋白質峰表達存在顯著差異，與竇卵泡液相比，Mr6622.43、Mr7525.63兩種蛋白質在成熟卵泡液表達上調，Mr2291.65、Mr9131.65兩種蛋

7、白質表達下降。 2．為推測這4種差異蛋白的類別，以測定的質/荷比為理論相對分子質量，同時按照所用的質譜儀的檢測誤差±0.1％設定相對分子質量的誤差，在ExPASy的SWISS-PROT蛋白質數(shù)據(jù)庫利用Tagldent tool根據(jù)分子量在人類蛋白質數(shù)據(jù)庫中模糊檢索卵泡液蛋白，只有Mr為6622.43的蛋白檢索到的結果是唯一的蛋白，可能是載脂蛋白C-I亞型前體，其余三種蛋白Mr7525.63、Mr2291.65、Mr9131.65

8、檢索結果不確定。 3．通過雙向凝膠電泳技術，獲得了較高分辨率的卵泡液蛋白質譜圖，共檢測到180多個蛋白質點。根據(jù)ImageMaster軟件分析結果，并既往文獻報道，選擇了5種成熟卵泡液中表達顯著增高的、且既往文獻中未作過鑒定的差異蛋白質點進行MALDI-TOF分析。蛋白質點1是載脂蛋白E(ApoE)，蛋白質點5為轉鐵蛋白(TRF)，而蛋白質點2 PRO2044和蛋白質點3 Hypotheticalprotein根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫鑒定

9、分析結果看，可能是血清白蛋白的修飾產物。蛋白質點4鑒定的結果是IgG heavy chain，僅用MS技術不足以確定IgG重鏈的具體分型。載脂蛋白E及轉鐵蛋白在卵母細胞發(fā)育成熟過程中的作用目前未見系統(tǒng)性的研究報道。 4．在昆明系小白鼠未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)體系中加入TRF，與對照組(單純FSH組)相比，高濃度TRF組的卵母細胞GVBD發(fā)生率和PBI排出率顯著降低；但經TRF培養(yǎng)成熟的M Ⅱ期卵母細胞正常受精率與對照組相比顯著升高

10、，差異有統(tǒng)計學意義。 5．在昆明系小白鼠未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系中加入AnoE，與對照組(單純FSH組)相比，隨著ApoE的濃度增加，卵母細胞的GVBD發(fā)生率和PB Ⅰ排出率顯著降低，二者負相關；且經ApoE培養(yǎng)成熟的M Ⅱ期卵母細胞正常受精率不隨著ApoE的濃度增加而改變，與對照組相比無顯著差異。 結論: 1．采用SELDI-TOF-MS以及2-DE兩種蛋白質組學方法，從整體水平上建立了卵泡發(fā)育成熟不同階

11、段的卵泡液蛋白質圖譜，發(fā)現(xiàn)在卵泡發(fā)育的不同階段，卵泡液蛋白質組分種類基本一致，僅有數(shù)種蛋白質在表達量上存在顯著差異。篩選鑒定了5種差異蛋白，分別是載脂蛋白E(ApoE)、PRO2044、Hypothetical protein、IgG heavy chain及轉鐵蛋白(TRF)，其中載脂蛋白E及轉鐵蛋白在卵母細胞發(fā)育成熟過程中的作用目前未見系統(tǒng)性的研究報道。這些蛋白可能在卵母細胞發(fā)育成熟過程中發(fā)揮關鍵作用，或是卵母細胞發(fā)育成熟的標志物，

12、為研究卵母細胞成熟機制，和今后建立更完善的卵母細胞體外培養(yǎng)體系提供了理論依據(jù)。 2．在小鼠未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)體系中加入TRF進行干預，發(fā)現(xiàn)高濃度TRF抑制體外培養(yǎng)的小鼠卵母細胞發(fā)生減數(shù)分裂。正常生理狀態(tài)下只有FSH受體表達最多的卵泡才能克服高濃度的TRF阻礙得以發(fā)育，卵母細胞發(fā)生減數(shù)分裂進而成熟。因此TRF是卵泡發(fā)育，特別是優(yōu)勢卵泡選擇形成過程的重要局部調節(jié)因子，并參與卵母細胞受精過程。 3．ApoE可能通過抑制卵泡