幽門螺桿菌napA基因的克隆、表達(dá)及NAP蛋白抗原表位研究.pdf

1、一、研究背景和目的 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種微需氧革蘭陰性螺旋桿菌，可導(dǎo)致胃炎和消化道潰瘍，并與胃腺癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織(gastricmucosal-associated lymphoid tissue lymplloma，MAIT)淋巴瘤病的發(fā)生密切相關(guān)，全球人口感染率超過50％，1994年被國際癌癥研究中心定為Ⅰ類致癌物。 目前，臨床上多采用質(zhì)子泵抑制劑和抗生素聯(lián)合治療

2、，但存在耐藥性、病人依從性差、易復(fù)發(fā)等副問題，效果不甚理想。因此，疫苗是防治Hp感染的有效手段，篩選免疫保護(hù)力強(qiáng)的無毒抗原是研制疫苗的關(guān)鍵。研究較多的抗原主要有尿素酶B(Urease B)、空泡毒素(Vacuolatint cytotoxin A，VacA)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(Cytotoxin associated protein A，CagA)等，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中雖顯示一定的免疫保護(hù)作用，但都具有一定的局限性，迄今未有理想的疫苗問世。

3、 中性粒細(xì)胞激活蛋白(Neutrophil-activating protein，NAP)是近期發(fā)現(xiàn)的與黏附和炎癥相關(guān)的重要毒力因子，由napA基因編碼，分子量為15kDa，4股螺旋結(jié)構(gòu)的單體構(gòu)成十二聚體鐵蛋白，NAP與細(xì)菌DNA保護(hù)性蛋白(Dps)及鐵蛋白(Flp)具有高度同源性，存在于所有菌株中。NAP能持續(xù)趨化和激活嗜中性粒細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)胃上皮細(xì)胞的黏附，刺激胃黏膜上皮細(xì)胞快速反應(yīng)，通過上調(diào)VCAM-1、ICAM-1

4、、E選擇素和前炎癥細(xì)胞因子及趨化因子促進(jìn)白細(xì)胞的募集，并促使中性粒細(xì)胞釋放反應(yīng)性氧代謝物，引發(fā)胃黏膜炎癥病變。多數(shù)Hp感染者血清中存在抗NAP抗體，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)NAP免疫小鼠可抵抗Hp的感染，保護(hù)率達(dá)80％?？梢姡琋AP是Hp重要的毒力因子及候選抗原。本研究在克隆表達(dá)NAP的基礎(chǔ)上，展開NAP的表位組學(xué)研究，利用噬菌體肽庫展示技術(shù)，尋找NAP精確的抗原表位，為篩選更多的保護(hù)性抗原表位及制備多價(jià)合成肽亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)；展開胃癌、消化道潰

5、瘍、胃炎病人與正常人群抗NAP抗體水平的調(diào)查，探討NAP與胃癌之間的相關(guān)性，并對(duì)獲得的3株抗NAP單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAb)進(jìn)行鑒定，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。 二、研究方法 1、根據(jù)GenBank提供的Hp 26695株基因組序列設(shè)計(jì)引物，以NCTC 11639基因組為模板，擴(kuò)增napA基因，連接pMD18-T載體，構(gòu)建napA/pMD18-T重組克隆，PCR及雙酶切鑒定后測(cè)序，將重組質(zhì)

6、粒napA/pMDl8-T與表達(dá)載體pGEX-4T-1用EcoR Ⅰ和XholⅠ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化宿主菌Top10，構(gòu)建融合表達(dá)載體napA/pGEX-4T-1，雙酶切后測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析：利用BLAST工具進(jìn)行同源性搜索；利用DNAMAN軟件分析napA的DNA序列和編碼蛋白的特性；利用harvard大學(xué)的在線軟件進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)；應(yīng)用Signal P3.0 server分析氨基酸序列中是否存在信號(hào)肽。 2、利

7、用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，優(yōu)化表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)融合蛋白的可溶性表達(dá)，通過GST親和層析柱純化NAP蛋白，SDS-PAGE電泳及Western Blot鑒定表達(dá)蛋白。 3、利用間接ELISA法，以純化蛋白NAP與Hp陽性胃癌、消化道潰瘍、胃炎患者血清及正常人群血清進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)NAP的免疫反應(yīng)性，比較NAP在胃病人群及正常人群的抗體水平，探討NAP與胃癌的相關(guān)性。4、以天然的Hp全菌蛋白為抗原免疫BALB/C小鼠，利用雜交瘤技術(shù)制

8、備mAb。利用間接ELASA法，鑒定mAb與腸道致病菌交叉免疫反應(yīng)，以NAP蛋白為抗原，從不與腸道致病菌發(fā)生交叉免疫反應(yīng)的mAb中篩選抗NAP mAb。利用鼠mAb亞類檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，鑒定抗NAP mAb的亞類；采用間接ELISA法測(cè)定抗NAP mAb抗體效價(jià)；選用間接ELISA方法，測(cè)定抗NAP mAb濃度，按公式Kaff=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)計(jì)算親和常數(shù)。將抗NAP mAb與10株常見

9、腸道致病菌進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)，鑒定抗體反應(yīng)的特異性；將NAP mAb與Hp涂片樣本及Hp感染患者胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)，鑒定mAb反應(yīng)的敏感性。 5、利用噬菌體隨機(jī)7肽庫，以抗NAP mAb(E019)為固化抗原，通過EIASA法篩選陽性噬菌體克隆，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制試驗(yàn)鑒定NAP的抗原表位。 三、研究結(jié)果 1、成功擴(kuò)增及克隆NCTC11639株napA基因，基因全長435bp。結(jié)果已登錄GenBank，登錄號(hào)為DQ

10、341279。 2、BIAST同源檢索顯示該基因與GenBank中公布的其它20株菌株的napA基因的核酸序列相比有高度同源性(94％～98％)；napA基因編碼蛋白與細(xì)菌DNA保護(hù)性蛋白(Dps)及鐵蛋白具有高度同源性，與人及哺乳動(dòng)物基因組DNA同源性很低(<10％)。 3、經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性指數(shù)、信號(hào)肽、三維結(jié)構(gòu)分析顯示有4個(gè)高抗原性肽段，分別是第4～24，55～77，95～103，118～140氨基酸序列，

11、平均抗原指數(shù)為1.0236，其中118～140長22個(gè)氨基酸殘基的肽段抗原性指數(shù)1.15，親水性強(qiáng)、含有1個(gè)B轉(zhuǎn)角，表明該肽段可能含有良好的抗原表位。 4、PCR證實(shí)napA在Hp菌株中普遍存在，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道相同，說明該基因高度保守。 5、構(gòu)建napA-pGEX-4T-1-E.coli Top 10高效可溶性原核表達(dá)系統(tǒng)，通過優(yōu)化表達(dá)條件，確定最佳表達(dá)條件為1mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度，誘導(dǎo)溫度30℃，誘導(dǎo)時(shí)間4

12、 h。 6、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GST親和層析純化，獲得純度較高且有生物活性的目的蛋白，分子量是44Kda。重組NAP與患者血清及購買的商品化兔抗全菌Hp抗體之間可發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，不與正常人血清反應(yīng)，說明重組NAP具有良好的免疫反應(yīng)性。 7、Hp IgG抗體試劑盒檢測(cè)結(jié)果表明：64％正常人群Hp感染陽性，均值為0.46±0.27；70％胃癌患者Hp感染陽性，均值為0.55±0.13；68％胃潰瘍患者Hp感染陽性均值為0.43±

13、0.21；64％胃炎患者Hp感染陽性，均值為0.68±0.13。 8、NAP抗體水平檢測(cè)結(jié)果表明：97.5％胃癌患者血清中NAP抗體檢測(cè)結(jié)果陽性，均值為1.01±0.13；92.9％胃潰瘍患者血清中NAP抗體檢測(cè)結(jié)果陽性，均值為0.98±0.17；85.7％胃炎患者血清中NAP抗體檢測(cè)結(jié)果陽性，均值為0.89±0.07；正常人群血清中60％NAP抗體檢測(cè)結(jié)果陽性，均值為0.61±0.14。20～29歲與40～49歲年齡段抗體水平

14、有明顯差異(*P<0.05)，其它年齡段NAP抗體水平無明顯差異。 9、從29株小鼠抗Hp全菌mAb中篩選獲得3株抗NAP的mAb，mAb經(jīng)亞類鑒定顯示全部為IgGl，抗體效價(jià)為1:16至1:32，抗體親和力為1×10<'10>至5.2×10<'12> mol/L。Western blot鑒定表明，NAP蛋白可與NAP mAb之間發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)。免疫組化結(jié)果表明，3株mAb特異性較高，敏感性強(qiáng)，能與Hp純培養(yǎng)物及Hp感染胃黏膜標(biāo)

15、本發(fā)生強(qiáng)陽性反應(yīng)，不與其他腸道菌發(fā)生反應(yīng)。 10、利用噬菌體肽庫技術(shù)，初步篩選到NAP的線性表位(FAHLATQ)。 四、結(jié)論 1、本研究首次從國際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC 11639基因組DNA中克隆中性粒細(xì)胞激活蛋白基因napA，Genbank登錄號(hào)DQ341279。 2、成功構(gòu)建napA-pGEX-4T-1-E.coli Top 10高效可溶性原核表達(dá)系統(tǒng)。重組NAP經(jīng)鑒定具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可作

16、為Hp基因工程亞單位疫苗的候選組分，并為研究Hp致病機(jī)制、免疫保護(hù)機(jī)制及診斷試劑奠定基礎(chǔ)。3、NAP是高度保守的基因，是良好的免疫原。初步預(yù)測(cè)NAP有4個(gè)高抗原性肽段，其中118～140肽段可能含有良好的抗原表位。 4、成功制備高親和力抗NAP全菌mAb，3株mAb(E006、E019、E023)特異性高，敏感性強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用前景。 5、Hp在廣東地區(qū)的胃病及正常人群中感染率較高；NAP抗體表達(dá)水平高顯示NAP與胃癌