膠原復合梯度磷酸三鈣修復關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、骨性關節(jié)炎和創(chuàng)傷是臨床上造成關節(jié)軟骨損傷的常見原因，隨著現(xiàn)代社會人口老齡化及經濟的發(fā)展，關節(jié)軟骨損傷的發(fā)生明顯增加，損傷后的自身修復能力低下，常引起嚴重的關節(jié)功能障礙。目前臨床有多種治療方法，但效果均不能令人滿意，組織工程軟骨的發(fā)展為關節(jié)軟骨缺損的修復帶來了光明前景。但新生軟骨與關節(jié)下骨及與周圍軟骨的結合問題有待解決。 本實驗擬對新型雙向三維支架材料膠原復合梯度磷酸三鈣在體外與軟骨細胞的相容性和吸附性進行研究，評價其作為軟骨組織

2、工程支架的可行性。并用新型雙向三維可降解生物活性材料--膠原復合梯度磷酸三鈣對動物關節(jié)軟骨損傷缺損進行修復，以促使其軟骨自身再生，以期獲得高質量、穩(wěn)定結合的關節(jié)軟骨。 材料與方法： 1.實驗主要試劑 A.特殊組化染色試劑：甲苯胺藍 B.免疫組化試劑： CollagenlIAb單克隆抗體SABC試劑盒：即用型DAB顯色試劑盒 C.細胞分離及培養(yǎng)試劑： Dulbecco改良DMEM/H

3、amF12混合培養(yǎng)基胎牛血清II型膠原酶鏈球菌蛋白酶 2.材料 (1).動物來源： 6～8周齡新西蘭大白兔，體重2～2.5kg，雌雄不限，購于嶺南試驗動物中心。 (2).膠原復合梯度磷酸三鈣支架材料： 支架材料由華南理工大學生物材料研究所研制提供，I型膠原為基材，與具有良好生物活性的磷酸三鈣粉體共混交聯(lián)，經冷凍干燥成型。其中膠原為支架主體，材料上面1mm為純膠原，以下磷酸三鈣粉體呈梯度分布，濃度由

4、下而上遞減。將制備好的柱狀膠原磷酸三鈣復合材料冷凍干燥后，經環(huán)氧乙烷氣體消毒后備用。 3.實驗方法 (1)軟骨細胞的提取及培養(yǎng) 大白兔空氣栓塞處死后。在無菌條件下用手術刀取出雙側膝關節(jié)軟骨，切成約1mm3的碎片。用酶消化法提取兔關節(jié)軟骨細胞。加入原代軟骨細胞培養(yǎng)液DMEM/HamF12進行細胞培養(yǎng)，并行倒置顯微鏡觀察。 (2)軟骨細胞與支架材料復合培養(yǎng) 將膠原復合梯度磷酸三鈣支架材料修剪成直徑4m

5、m、厚1mm圓盤狀，置入6孔培養(yǎng)板，取第3代軟骨細胞接種于支架材料內，進行復合培養(yǎng)。 (3)軟骨細胞與支架材料相容性觀察 培養(yǎng)3，7d后，分別取出復合細胞的支架材料常規(guī)行HE染色，II型膠原免疫組織化學染色。 (4)掃描電鏡觀察細胞在材料上的黏附狀態(tài) 復合細胞的支架培養(yǎng)3，7d后以2.5％的戊二醛固定，梯度酒精脫水，叔丁醇置換，真空干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡下觀察細胞在材料表面及內部的黏附形態(tài)。

6、 (5)創(chuàng)傷性關節(jié)軟骨缺損動物模型制備 魯米那靜脈麻醉實驗動物，取膝關節(jié)外側切口，暴露股骨外側髁關節(jié)面，在其股骨外側髁關節(jié)面用電鉆鉆出直徑4mm，深3mm的圓柱狀缺損，形成創(chuàng)傷性關節(jié)軟骨缺損動物模型。 (6)Co/TCP復合材料修復軟骨的動物實驗 30只大白兔雙膝人為形成關節(jié)軟骨缺損，選擇右膝為實驗組，嵌入大小、形狀與缺損相似的Col/TCP；左側為對照組，缺損不予處理，縫合關節(jié)囊和皮膚。術后膝關節(jié)不固定，置籠

7、內自由活動。于術后4、6、8、12和24周空氣栓塞法各處死6只分別取材。 (7)再生軟骨組織的檢測 1)大體觀察術后觀察動物活動、步態(tài)、傷口愈合及缺損修復情況、膝關節(jié)有無攣縮、粘連和新生物、修復組織的平整性、光澤度及與周圍組織的結合情況。 2)組織學觀察取雙膝股骨外髁標本，4％多聚甲醛固定，EDTA脫鈣，常規(guī)石蠟包埋切片，甲苯胺藍染色和HE染色行組織學觀察，并采用盲法對各標本進行組織學評分，評分標準采用Wakit

8、anifa法。 3)II型膠原免疫組織化學染色常規(guī)石蠟切片，按免疫組織化學試劑盒說明進行操作，DAB顯色。通過Photoshop7.0計算圖像平均像素密度，取每張切片修復組織與正常關節(jié)軟骨像素強度比值作為統(tǒng)計指標。行統(tǒng)計學分析。 4)透射電鏡觀察實驗組和對照組取缺損區(qū)表層新生組織，2.5％戊二醛及1％OsO4雙固定，常規(guī)脫水包埋切片、鉛鈾雙染，在透射電鏡下觀察。 結果： 1.材料的形態(tài)和孔隙率 掃

9、描電鏡可以觀察到支架材料具有疏松多孔結構，孔隙結構規(guī)則，孔徑約100～150μm，材料內部孔與孔之間貫通良好通過排水法測定材料的孔隙率大于90％。 2.倒置相差顯微鏡觀察 倒置顯微鏡觀察：原代軟骨細胞，懸浮于培養(yǎng)液中，呈球形。4d后細胞貼附著尼龍紗巾生長，形狀不一；還可見細胞貼壁生長，呈多邊形，可見細胞核分裂相，細胞增殖極緩慢。經1～3代傳代培養(yǎng)，細胞體積增大突起增多，可見細胞聚集成簇，有核分裂相的細胞較少。4或5代細胞

10、呈去分化表現(xiàn)，細胞變成長梭形可沿一個方向排列生長，呈纖維細胞樣，核分裂相仍少見，胞漿中仍有較多顆粒，細胞匯合、相互接觸時不恢復原來形態(tài)。 3.軟骨細胞復合支架材料組織學觀察 1)HE染色 支架材料復合軟骨細胞培養(yǎng)3天后，孔隙內可見大量細胞，多數(shù)細胞呈多角形或者不規(guī)則形，少數(shù)呈短梭形，于細胞周圍間隙可見基質成分。支架材料復合軟骨細胞培養(yǎng)7天細胞廣泛分布于支架材料孔隙，呈梭形或圓形，核呈圓形或橢圓形，胞質透亮均勻，細

11、胞核輪廓清楚。 2)免疫組織化學染色 支架材料復合軟骨細胞培養(yǎng)3天后，材料孔隙中可見大量復合于支架材料上的細胞，胞漿內可見棕黃色顆粒，細胞周圍出現(xiàn)黃染區(qū)。支架材料復合軟骨細胞培養(yǎng)7天胞漿及細胞周圍棕黃色更加明顯。 4.膠原復合梯度磷酸三鈣支架材料與軟骨細胞相容性的觀察：細胞基質材料體外培養(yǎng)3天后，掃描電鏡觀察見大量細胞粘附于支架材料上并向深部孔隙長入，已開始分泌出較多膠原纖維，7天后細胞成團狀，互相有纖維連接。

12、 5.膠原復合梯度磷酸三鈣支架材料修復兔關節(jié)軟骨的大體觀察 術后前3d，所有實驗兔稍跛行，雙膝活動少，隨后活動逐漸增加；2周后行走如常，全部術膝傷口愈合良好，無感染表現(xiàn)。 實驗組術后4周缺損區(qū)由白色組織完全充填，表面較光滑，有光澤，與正常軟骨的界線模糊；術后6周修復組織完全填平缺損區(qū)，呈白色；術后8周修復組織中心部分顏色接近正常軟骨組織，僅見邊緣有小部分組織顏色略深，表面光滑，部分邊界已融合；術后12周時修復組織外

13、觀與正常軟骨組織相似，與周圍正常軟骨不容易辨別；術后24周修復組織同12周時相似。 對照組術后4周缺損處有白色纖維組織不完全填充，創(chuàng)面邊緣仍呈紅色；術后8周缺損處由白色纖維樣組織填充，但表面十分粗糙，與周邊正常組織界線清晰；術后12周缺損處修復組織呈白色，可見表面有裂隙；術后24周缺損處白色修復組織表面粗糙，與正常組織的界線仍清楚。 6.膠原復合梯度磷酸三鈣支架材料修復兔關節(jié)軟骨的組織學觀察 1)HE及甲苯胺藍染

14、色 實驗組術后4周，修復區(qū)見較多幼稚軟骨細胞，表層細胞體積較小，數(shù)量稍多，呈水平狀排列，深層細胞體積較大，排列不規(guī)則，修復面尚平整，與周圍組織分界清楚，支架材料基本降解吸收；術后6周及8周，修復組織中可見明顯增多的軟骨細胞，與軟骨下骨結合欠密切，軟骨陷窩多見，細胞分布不均；術后12周修復組織和周圍軟骨整合緊密、厚度相近，其形態(tài)、排列、基質染色與正常軟骨相似，可見“潮線”形成，淺層軟骨細胞胞體較小，與關節(jié)面平行，深層細胞排列呈柱狀

15、，與關節(jié)面垂直，軟骨下骨板基本修復；術后24周再生軟骨組織同12周無明顯變化。整個觀察期，實驗組修復區(qū)組織內未見淋巴細胞浸潤和血管侵入。 對照組術后4周，缺損區(qū)為纖維組織覆蓋，表面明顯凹陷，可見血管侵入；6～24周，缺損區(qū)仍由纖維組織覆蓋，修復組織與鄰近組織分界清楚，表面凹陷，修復組織染色弱而不均勻，可見血管侵入。術后4、6、8、12、24周實驗組組織學評分分別為7.60±0.98、5.69±0.58、4.46±0.85、4.3

16、5±0.12、4.41±0.58；對照組分別為10.25±1.05、9.04±0.96、8.96±0.88、8.88±0.68、8.66±0.54，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義。 2)II型膠原免疫組織化學染色 整個觀察期內實驗組新生組織基質內及軟骨細胞胞漿內均有II型膠原陽性表達，術后12周及24周的表達強于術后4～8周，同正常軟骨接近；對照組為陰性。 計算平均像素強度行II型膠原半定量分析,同一時間點實驗組與對照

17、組比較差異有統(tǒng)計學意義。 3)透射電鏡觀察 實驗組4周，可見幼稚軟骨細胞，細胞呈同源性集聚；12周，細胞形態(tài)具備透明軟骨細胞特征，胞質內可見多數(shù)擴張的粗面內質網(wǎng)和小而圓的線粒體；24周，透明軟骨細胞增多，形態(tài)更加成熟，細胞表面有短嵴狀突起，粗面內質網(wǎng)豐，網(wǎng)池略擴張，并可見糖原顆粒，細胞周圍有明顯的膠原纖維并形成陷窩。 對照組4周，可見粗大纖維組織，散在纖維細胞；12周，仍為纖維組織特征；24周，全部為粗大的膠原纖