Fank1基因敲減小鼠模型的建立及其在雄性小鼠生殖功能中的研究.pdf

1、在現代社會不育癥己成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾病，生殖健康逐漸引起人們的普遍重視。目前，全球大約有15％的夫婦受到不育癥的困擾，導致男性不育最主要的原因是由精子生成障礙引起的[1]。為了從根本上實現對男性不育的診療，需要對精子的發(fā)生過程和機制有更深入的研究。精子發(fā)生是一個非常復雜的生理過程，并且在這個過程中存在許多睪丸特異性的基因表達，由此產生一些酶類和蛋白質來調節(jié)精子的發(fā)生。許多睪丸特異性基因具有發(fā)育階段特異性和組織細胞特異

2、性等表達特征，這些特異性基因參與精子發(fā)生過程中特異的細胞活動，如減數分裂、遺傳物質重組和染色質的濃縮以及發(fā)育后期的變態(tài)過程。當睪丸特異基因出現異常會導致少精、弱精或精子畸形等現象發(fā)生。
　　 Fank1基因是我們實驗室最新篩查到的一個睪丸特異表達基因[7]，該基因位于7號染色體，是由FnⅢ結構域和5個錨定蛋白組成的，編碼一種核蛋白，該蛋白是一種睪丸組織特異轉錄因子。并且Fank1基因在11種脊椎動物中高度保守，其中小鼠和人的Fa

3、nk1基因同源性高達85％，說明該基因在精子發(fā)生過程中具有重要的生理作用。Fank1基因在精子發(fā)生過程的減數分裂到單倍體階段廣泛表達，研究其特性和功能對揭示精子發(fā)生的內在機理、防治由精子發(fā)生異常引起的男性不育及開發(fā)避孕藥物等方面有重要意義。因此通過RNA干擾的方法建立Fank1基因敲減轉基因小鼠不育模型，并對基因敲減小鼠模型進行傳代功能分析和表型分析，來進一步研究Fank1基因在精子發(fā)生過程中的功能及其在男性不育中的作用及意義。

4、　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、人胚腎細胞系293T
　　 2、SPF級C57BL/6小鼠、B6D2F1小鼠和ICR小鼠
　　 3、細胞培養(yǎng)及細胞轉染相關試劑
　　 4、分子克隆及PCR實驗相關試劑
　　 5、RT-PCR、Real-time PCR和microRNA提取等相關試劑
　　 6、Southern blot、Western blot等相關試劑

5、　　 二、實驗方法
　　 1、Fank1干擾載體的構建及在細胞水平的鑒定
　　 （1）pSUPER-shFank1重組質粒的構建和pDsRed-Fank1融合表達構件的制備
　　 根據Fank1基因cDNA序列，應用http：//www.dharmacon.com/在線設計軟件設計2條干擾序列，分別克隆至帶有H1啟動子的質粒載體pSUPER-neo-GFP中，同時從成年C57BL/6小鼠睪丸組織擴增Fank1基

6、因全序列，構建Fank1基因與紅色熒光蛋白重組表達質粒pDsRed-Fank1。
　　 （2）將上述兩個質粒共轉染293T細胞，分別應用熒光檢測、RT-PCR和Western blot等方法檢測Fank1干擾載體干擾效率。
　　 2、Fank1基因敲減小鼠模型的建立
　　 （1）選取干擾效率高的siRNA表達質粒，經單酶切后，采用凝膠純化試劑盒純化，通過顯微注射的方法注射到BDF1小鼠受精卵中，將注射基因的受精卵

7、移植到假孕母鼠輸卵管內，利用PCR和Southern blot方法對仔鼠進行檢測。
　　 （2）Fank1基因敲減轉基因小鼠繁育。
　　 3、Fank1基因敲減轉基因小鼠表型分析
　　 （1）提取Fank1基因敲減轉基因小鼠睪丸組織microRNA，應用RT-PCR技術檢測Fank1 siRNA在基因敲減轉基因小鼠睪丸組織的表達情況。
　　 （2）通過RT-PCR、Real-time PCR和Wester

8、n blot方法檢測Fank1基因在基因敲減小鼠體內的表達情況。
　　 （3）對Fank1基因敲減轉基因小鼠和野生型小鼠的睪丸重量、精子的數量進行比較和統計學分析；
　　 （4）Fank1基因敲減轉基因小鼠與野生型小鼠交配，比較產仔數量及產仔周期并進行t檢驗統計學分析。
　　 結果：
　　 1、經PCR檢測鑒定含干擾序列的重組質粒pSUPER-shFank1631＃，pUPER-shFank1247＃及p

9、DsRed-Fank1表達質粒構建成功，測序結果完全正確。
　　 2、轉染293T細胞36h后，熒光顯微鏡檢查發(fā)現shFank1631＃、247＃均能明顯抑制紅色熒光蛋白表達，抑制效率分別為95％和90％，RT-PCR和Western blot結果表明Fank1基因在轉錄和翻譯水平都受到顯著抑制（p<0.05）。
　　 3、利用顯微注射法將pSUPER-shFank1631＃注入BDF1小鼠受精卵原核中，共注射285枚胚

10、胎，存活203枚，將注射后存活的受精卵分別移植到8只ICR假孕雌鼠輸卵管內，共產仔53只，經PCR及Southern blot檢測后共14只陽性小鼠，陽性率為26.4％。
　　 4、Fank1 siRNA在基因敲減小鼠睪丸組織中均特異表達。采用半定量RT-PCR檢測基因敲減小鼠睪丸組織Fank1 mRNA表達與正常小鼠相比明顯降低。在RT-PCR的基礎上，又采用Real Time-PCR和Western blot的方法檢測Fan

11、k1基因在基因敲減小鼠的表達。結果顯示基因敲減小鼠的Fank1基因表達量與野生型小鼠比較都有不同程度的降低，其中F01、F02、F011、F045 Founder轉基因小鼠Fank1基因表達明顯下調。
　　 5、成年Fank1基因敲減雄性小鼠睪丸組織重量和野生型雄性小鼠睪丸組織重量進行比較，無顯著性差異（p>0.05）。
　　 6、經統計學分析，Fank1基因敲減小鼠精子數量、產仔周期和產仔數量與野生型比較均有顯著性差異