內皮祖細胞對單側輸尿管梗阻大鼠腎小管周毛細血管重建的實驗研究.pdf

1、背景和目的:
　　 慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是世界范圍內的健康問題,最終不可逆地發(fā)展為終末期腎衰(end stage renal failure,ESRF)。目前終末期腎衰的臨床治療主要依靠替代治療或腎移植,但透析治療病人有著相當高的死亡率和大量并發(fā)癥,而且由于供體的缺乏及移植后昂貴的免疫抑制劑,腎移植的應用也受到了限制。因此探討更為有效的慢性腎臟病的防治方法,抑制慢性腎臟病進展和促進腎

2、組織修復已成為腎臟病研究的重要領域。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)CKD進展的最終共同通路是小管間質纖維化,CKD患者腎功能不全更大程度上與小管間質纖維化程度相關。大量的研究證實腎小管周毛細血管的丟失和低氧是小管間質損傷纖維化的最終共同通路,而前者是低氧的主要原因之一。低氧導致腎實質細胞凋亡,并促進致纖維化因子、炎癥因子等分泌。還有研究發(fā)現(xiàn)血管損傷最易導致血管周細胞移動和分化成肌成纖維細胞,提出對纖維化的研究重點應該是血管,而不僅僅是上皮

3、細胞。故通過改善腎小管周微血管的密度,改善缺氧,延緩甚至逆轉CKD的進展具有重要意義。
　　 血管的生成一般認為是通過成熟內皮細胞增生、移動,以出芽方式完成,稱為血管生成(angiogenesis),而另外還有一種生成血管的機制是通過內皮祖細胞(endothelialprogenitor cells,EPCs)分化形成血管,稱為血管發(fā)生(vasculogenesis)。后者通常被認為僅僅存在于胚胎血管形成。自從1997年Asah

4、ara及同事成功分離出外周血中EPCs后,這種觀點已得到改變。EPCs是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內皮細胞,但尚未表達成熟血管內皮細胞表型,也未形成血管的前體細胞。EPCs在心腦血管和外周血管重建方面得到了廣泛的研究。研究發(fā)現(xiàn)內皮祖細胞不僅能直接增殖、分化為內皮細胞,參與形成新的血管結構,還能分泌許多生長因子,如血管內皮生長因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(F

5、ibroblast growth factor,bFGF);分泌一些生物活性物質如NO,影響內皮功能;通過自分泌和旁分泌的方式參與內皮修復?？梢?內皮祖細胞在成體參與血管修復過程中是以一種類似于胚胎血管發(fā)生的方式進行,強調了細胞因子和細胞的協(xié)同作用,因而形成更加完整成熟的血管。
　　 已有的研究發(fā)現(xiàn)在CKD早在第1期就存在EPCs數(shù)量和功能的減少,而腎移植后有所改善,還有研究發(fā)現(xiàn)骨髓源的EPCs能修復腎小球毛細血管。既然CKD存

6、在EPCs數(shù)量和功能的減少,那么通過EPCs移植是否就能重建腎小管周毛細血管,從而改善由于低氧導致的CKD進行性惡化呢?其可能的機制又如何呢?為此,本研究首先在體外觀察了低氧刺激腎小管上皮細胞的條件培養(yǎng)液對體外擴增的EPCs增殖、遷移和分泌血管生成因子的影響;然后在動物體內觀察了EPCs移植對單側輸尿管梗阻大鼠的腎小管周毛細血管密度和小管間質纖維化的改善和可能的機制;作為參與缺血誘導EPCs動員的最重要和最終的趨化因子--基質細胞衍生因

7、子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)是否也參與了EPCs在腎間質的歸巢。
　　 方法:
　　 本課題第一部分采用內皮祖細胞選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和誘導分化密度梯度離心法獲得的大鼠骨髓源性單個核細胞,以獲得大鼠骨髓源性EPCs,并通過攝取acLDL-DiI和結合FITC-lectin熒光雙染、免疫熒光檢測細胞表面干細胞抗原及內皮細胞特異性抗原鑒定。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞,低

8、氧處理腎小管上皮細胞后獲得條件培養(yǎng)液(Conditioned medium,CM),常氧處理后獲得的條件培養(yǎng)液作為對照組,采用逆轉錄多聚酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和westernblot檢測低氧刺激后腎小管上皮細胞SDF-1和VEGF的表達。經CM處理大鼠骨髓源EPCs后,采用MTT分析其增殖、遷移能力,采用RT-PCR和Western blo

9、t檢測CM作用后EPCs分泌VEGF、血管生成素-1(angiogenin-1,Ang-1),表達C-X-C家族趨化因子受體(C-X-C chemokine receptor,CXCR4)的變化。
　　 本課題第二部分采用單側輸尿管梗阻(unilateral reteral obstruction,UUO)間質纖維化模型,體外擴增并標記EPCs后移植。分組如下:
　　 1.假手術對照組(Sham operationgro

10、up):簡稱為Sham組,n=15只。手術入路方式同UUO組,進腹腔后分離左輸尿管但不結扎輸尿管。術中經左腎動脈注射0.01mol/L PBS1ml。
　　 2.移植對照組(transplantation control group):簡稱sham+EPCs組,n=15只。手術入路方式同UUO組,進腹腔后分離左輸尿管但不結扎輸尿管。術中經左腎動脈注射0.01mol/L PBS1ml稀釋EPCs107個。
　　 3.單側輸

11、尿管梗阻組(Ulateral ureteral obstruction group):簡稱為UUO組,n=15只。大鼠行左側輸尿管結扎術。術中經左腎動脈注射0.01mol/L PBS1ml。
　　 4.移植組(Transplantation group):UUO+EPCs,n=15只。大鼠行左側輸尿管結扎術,術中經左腎動脈注射0.01mol/L PBS1ml稀釋的同窩來源EPCs107個。
　　 7d,14d,21d,每

12、組隨機抽取5只動物處死,采集尿液、血液及腎臟組織標本,觀察不同時間點以下指標的變化:①檢測腎重/體重、24小時尿蛋白定量以及血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐水平。②HE、PAS和Masson染色后在光鏡下觀察腎組織形態(tài)改變,并進行小管間質病變的病理損害積分。③免疫組織化學檢測腎小管周毛細血管密度(JG12)和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、SDF-1、VEGF、α

13、-SMA、HIF-1α的表達,采用western blot檢測SDF-1、VEGF和HIF-1α、Ang-1的表達。④采用熒光雙染對移植細胞定位,免疫熒光法檢測移植細胞的半定量。
　　 結果:
　　 第一部分:內皮祖細胞條件培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)的大鼠骨髓單個核細胞在7～10天呈梭形或紡錘形,類似于內皮細胞,絕大多數(shù)細胞可攝取acLDL-DiI,能結合FITC-lectin,免疫熒光檢測到既有干細胞抗原CD133、CD34,又有

14、內皮細胞特異性標志物VEGFR-2表達。組織塊貼壁法培養(yǎng)腎小管上皮細胞,在貼壁后24～48h腎小管節(jié)段周有上皮樣細胞長出,6～7天鋪滿瓶底,形態(tài)為多邊鵝卵石樣,免疫熒光角蛋白染色陽性。低氧作用腎小管上皮細胞48h后SDF-1和VEGF表達均有增加,5％氧濃度增加最為明顯。CM刺激EPCs后,EPCs增殖、遷移能力增強(P＜0.05),VEGF、Ang-1和CXCR4表達顯著強于對照組(P＜0.05)。
　　 第二部分:成功構建了

15、大鼠UUO模型,隨梗阻時間延長,梗阻側腎臟體積逐漸增大,腎盂內積液增加,腎實質變薄,鏡下第7天可見明顯的腎小管擴張、上皮細胞空泡變性、間質炎性細胞浸潤;第14天腎小管擴張更加明顯,上皮細胞有萎縮,有纖維化形成。
　　 結論:
　　 1.采用內皮祖細胞選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)和誘導分化密度梯度離心法獲得的骨髓單個核細胞,成功培養(yǎng)出了大鼠骨髓內皮祖細胞。
　　 2.采用組織塊貼壁法,成功培養(yǎng)了腎小管上皮細胞。
　　

16、3.低氧作用下腎小管上皮細胞VEGF和SDF-1表達增加;低氧作用腎小管的條件培養(yǎng)液(CM)促進內皮祖細胞增殖、遷移和VEGF、Ang-1、CXCR4表達,提示CM通過VEGF和SDF-1促進了內皮祖細胞的增殖、遷移、生存和成血管能力。
　　 4.EPCs移植改善了UUO大鼠梗阻腎臟的腎小管周毛細血管密度和小管間質損傷;
　　 5.UUO大鼠有SDF-1表達,提示其能促進EPCs歸巢,歸巢的EPCs參與了間質血管的重建;