右美托咪定鞘內(nèi)注射對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)GIRK1表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)由于易引起自發(fā)痛、痛覺過(guò)敏甚至痛覺超敏等異常疼痛癥狀，對(duì)患者生活質(zhì)量帶來(lái)極大影響。目前，糖尿病導(dǎo)致周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有不少學(xué)者認(rèn)為與中樞敏化有關(guān)。中樞敏化時(shí)，交感神經(jīng)節(jié)后纖維發(fā)生芽生現(xiàn)象，與背根神經(jīng)節(jié)形成“交感-感覺偶聯(lián)”，使得交感神經(jīng)末梢和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體之間形成直接和間接的類似于突觸的功能性結(jié)構(gòu)。有研究證實(shí)

2、糖尿病大鼠變性及再生的Aδ和C纖維及交感神經(jīng)芽枝上的α2腎上腺素能受體都具有高度的敏感性，當(dāng)交感神經(jīng)節(jié)后纖維興奮時(shí)，交感神經(jīng)末梢釋放出去甲腎上腺素并作用于α2腎上腺素能受體，激活背根神經(jīng)節(jié)傳入神經(jīng)元，使其產(chǎn)生敏感化和興奮的改變，從而引起痛覺過(guò)敏、痛覺超敏等癥狀。也有學(xué)者認(rèn)為糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的出現(xiàn)與離子通道活性改變有關(guān)。當(dāng)外周神經(jīng)發(fā)生損傷時(shí)，背根神經(jīng)節(jié)和軸突細(xì)胞電壓門控 K+,Na+,Ca2+等離子通道的表達(dá)及功能也發(fā)生改變，可導(dǎo)致自

3、發(fā)性的異位神經(jīng)放電及痛性神經(jīng)病變，并且，大量研究表明神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生和維持的重要機(jī)制之一是神經(jīng)異位放電。
　　G蛋白偶聯(lián)內(nèi)向整流鉀通道(GIRK)是7個(gè)內(nèi)向整流鉀通道亞家族中的一員，由5個(gè)亞單元組成，其中GIRK1～4亞單元已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，GIRK5亞單元也在爪蟾卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System,CNS），GIRK通道能與許多G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，如α2腎上腺素能受體、多巴胺能

4、受體、毒菌堿受體、γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）受體等相結(jié)合。生物體內(nèi)，GIRK以同源及異源多聚體的形式存在，受G蛋白調(diào)節(jié)，可直接與Gβγ結(jié)合并被激活，已證實(shí)可擴(kuò)散的 GIRK蛋白的 GIRK1-4亞單位與Gβγ的N及 C末端直接結(jié)合。GIRK具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞興奮性，靜息電位，神經(jīng)遞質(zhì)釋放，起慢突觸后抑制的作用，其在疼痛的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。并且，內(nèi)啡肽等內(nèi)源性疼痛調(diào)節(jié)物質(zhì)和一些鎮(zhèn)痛藥物均能激

5、活GIRK通道，激活的GIRK通道抑制神經(jīng)元的沖動(dòng)發(fā)放，發(fā)揮著減弱疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)的作用。
　　右美托咪定是一種高效、高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)藥?？赏耆せ瞀?B-AR，部分激活α2A-AR和α2C-AR。與可樂(lè)定相比，右美托咪定與α2-AR、α1-AR結(jié)合的比例為1620：1，遠(yuǎn)高于可樂(lè)定的300：1。右美托咪定能激活α2A-AR產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制交感活性等作用。在一項(xiàng)治療大鼠急性痛和神經(jīng)病理性疼痛的研究中發(fā)現(xiàn)，右美托咪定

6、對(duì)這兩種不同的疼痛均可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，并隨劑量的增大而增強(qiáng)。
　　目前，單次鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)GIRK1表達(dá)的影響仍未見報(bào)道。因而，本實(shí)驗(yàn)擬建立糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，采用單次鞘內(nèi)注射右美托咪啶的方法，觀察右美托咪啶對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠機(jī)械痛閾及背根神經(jīng)節(jié)GIRK1表達(dá)的影響，評(píng)價(jià)右美托咪定對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛所產(chǎn)生的抗傷害效應(yīng)及其可能存在的鎮(zhèn)痛機(jī)制，為開展臨床研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)

7、。
　　方法：
　　8-10周成年雄性SD大鼠100只，體重在200-220g之間，清潔級(jí)，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。造模前兩天，測(cè)大鼠雙側(cè)后足基礎(chǔ)50％機(jī)械縮足閾值(50%MWT)。禁食12小時(shí)，于造模當(dāng)天測(cè)量大鼠體重，空腹血糖值。隨機(jī)選取大鼠60只單次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）60 mg/kg，2周后，選取血糖值大于300mg/dL，且雙側(cè)后足50%機(jī)械縮足閾值（50%MWT）小于4g者為DNP模型成功。余下大鼠40只

8、為對(duì)照組，按2.8ml/kg的劑量腹腔注射枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。從DNP大鼠中隨機(jī)選取39只，分為D-D組（n=24，DNP大鼠鞘內(nèi)注射右美托咪定1.5ug/Kg）、D-C組（n=15，DNP大鼠鞘內(nèi)注射等容量生理鹽水）；從對(duì)照組大鼠中隨機(jī)選取39只，分為H-D組（n=24，大鼠鞘內(nèi)注射右旋美托咪定1.5ug/Kg）、H-C組（n=15，大鼠鞘內(nèi)注射容量的生理鹽水）。采用von frey細(xì)絲法測(cè)大鼠造模前、造模后14天機(jī)械痛閾，以及鞘

9、內(nèi)注射后0.5h、1h、2h、4h、6h、24h的機(jī)械痛閾。采用免疫熒光法測(cè)定大鼠背根神經(jīng)節(jié) GIRK1蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，Western blot法檢測(cè)GIRK1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．造模后大鼠生理和活動(dòng)的改變四組大鼠基礎(chǔ)血糖值無(wú)明顯差異（P＞0.05）。H-D組和H-C組大鼠接受腹腔注射后每日飲食尿量正常，性格溫順，第十四天毛色光滑柔軟，體重正常，血糖值較基礎(chǔ)血糖值無(wú)明顯變化（P＞0.05）；而D-D組和D

10、-C組大鼠則血糖值明顯升高（P＜0.05）,表現(xiàn)出明顯的糖尿病癥狀：毛發(fā)稀少，毛色暗淡，身形消瘦，體重減輕，每日飲食飲水及尿量均明顯增多，性格暴躁。H-D組和D-D組大鼠在鞘內(nèi)注射右旋美托咪啶后30min內(nèi)有輕微嗜睡現(xiàn)象，但可輕易喚醒，喚醒后活動(dòng)無(wú)明顯障礙。
　　2．機(jī)械疼痛閾值的變化造模前四組大鼠基礎(chǔ)50%MWT差異無(wú)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。D-D組與D-C組腹腔注射STZ14天后的50%MWT較基礎(chǔ)50%MWT均明顯降低

11、（P<0.05）。與H-D組及H-C組比較，D-D組與D-C組腹腔注射STZ14天后的50%MWT均明顯降低（P<0.05）。D-D組在鞘內(nèi)注射后0.5h、1h、2h、4h、6h各時(shí)間點(diǎn)50%MWT較D-C組明顯增高（P<0.05），但在24h時(shí)兩組50%MWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。H-D組在鞘內(nèi)注射后0.5h、1h、2h、4h、6h各時(shí)間點(diǎn)50%MWT較 H-C組明顯增高（P<0.05），在24h時(shí)兩組50%MWT差異無(wú)統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在0.5h、1h、2h、4h、6h各時(shí)間點(diǎn)H-D組與D-D組50%MWT均較腹腔注射14天后的50%MWT明顯增高（P<0.05），但兩組在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3．脊髓背根神經(jīng)節(jié)GIRK1蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較在DNP模型大鼠，D-D組在鞘內(nèi)注射后2h、4h、6h的GIRK1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較D-C組明顯增加（P<0.05）。在緩沖劑對(duì)照組模型，H-D組在鞘內(nèi)注射后2h、4

13、h、6h的 GIRK1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較H-C組明顯增加（P<0.05）。而且，在2h、4h、6h各時(shí)間點(diǎn)，D-D的GIRK1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較H-D組均有升高（P<0.05）。
　　4．脊髓背根神經(jīng)節(jié)GIRK1蛋白表達(dá)水平比較以GAPDH的IOD值作為內(nèi)參對(duì)照值，對(duì)兩組條帶進(jìn)行IOD值的大小進(jìn)行比較。GAPDH的分子量為36KD，GIRK1的分子量為56KD。D-D組與H-D組均有GIRK1蛋白表達(dá)。與H-D組比較，D-D組在鞘內(nèi)注