NGAL蛋白的重組表達與純化及其對食管癌細胞的體外誘導作用研究.pdf

1、汕頭大學博士學位論文NGAL蛋白的重組表達與純化及其對食管癌細胞的體外誘導作用研究姓名：張丕顯申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：李恩民許麗艷20090516汕頭大學醫(yī)學院博士學位論文時，兩種食管癌細胞EC1.71和EC109的形態(tài)均發(fā)生明顯改變，主要特征是細胞收縮變小，形態(tài)變圓，同時細胞數(shù)目也減少，細胞的貼壁能力下降；而兩種食管癌細胞EC1.71和EC109相比，應對NGAL蛋白的誘導作用，EC1.71似乎更敏感一些

2、，形態(tài)變化更顯著，細胞收縮更明顯。3）單丹磺酰戊二胺（Monodansylcadaverine，MDC）標記，綠色熒光檢測結果表明，與對照組相比，隨著NGAL蛋白濃度逐漸由低到高，特別是當濃度升高達到550μgml時，兩種食管癌細胞EC1.71和EC109的綠色熒光顯色均顯著變強，表明有明顯的細胞自噬發(fā)生。但兩種食管癌細胞EC1.71和EC109相比，在NGAL蛋白濃度相同條件下，似乎前者的綠色熒光顯色更強一些。這可能同樣與兩種細胞的N

3、GALR表達，以及其它相關分子的差異性本質有關。4）在pLC3GFP融合質粒預先轉染的基礎上，檢測LC3的異位分布變化情況，結果發(fā)現(xiàn)，在50μgml的NGAL蛋白作用后，無論是EC1.71，還是EC109，兩種食管癌細胞均發(fā)生了明顯的LC3易位分布變化，顯現(xiàn)典型的膜性易位聚集特征，表明細胞確實發(fā)生了自噬。5）有關NGAL蛋白對食管癌細胞內鐵離子與鐵蛋白水平影響的檢測結果表明，在本文的細胞模型實驗條件下，外源性NGAL蛋白的作用并未引起細

4、胞內的鐵離子濃度明顯改變，而細胞內鐵蛋白的表達水平也未受到明顯影響。6）有關NGAL蛋白激活食管癌細胞ERK細胞信號轉導通路的檢測結果表明，50μgml的NGAL蛋白僅分別作用5min，兩種食管癌細胞均出現(xiàn)了pERK12水平的明顯升高，而且在接續(xù)下來的30min24h時間范圍內一直保持著這種水平，而在此之前，至少NGAL蛋白作用6h，模型細胞尚未發(fā)生明顯的自噬現(xiàn)象。這表明ERK12激活是細胞自噬前的生物化學反應事件，可能是NGAL蛋白誘

5、導食管癌細胞發(fā)生自噬的分子機制關鍵環(huán)節(jié)所在。7）有關NGAL蛋白激活食管癌細胞p38和JNK細胞信號轉導通路的檢測結果表明，在NGAL蛋白作用下，細胞中p38和JNK等MAPK的活性有一定的變化，但不如ERK明顯。8）有關自噬相關基因atg5、beclin1和DAPK等的轉錄情況的檢測結果表明，NGAL蛋白的作用能夠使EC1.71和EC109，在前期激活ERK12之后，進一步導致atg5、beclin1和DAPK等自噬相關基因轉錄增強。