片球菌素PediocinPA-1在原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建及表達純化.pdf

1、目的:利用分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建編碼乳酸pediocinPA-1基因片段的原核表達載體，誘導(dǎo)表達，鑒定表達產(chǎn)物，并對表達產(chǎn)物進行純化。為探索天然乳酸pediocinPA-1的生物學(xué)活性及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)文獻報道的序列設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)特異性擴增PediocinPA-1的成熟肽pedA基因編碼片段，并將其克隆入原核表達載體pET-32b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32b(+)/pedA。經(jīng)限制性內(nèi)切酶kp

2、nⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定和DNA序列測定后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達組氨酸融合蛋白。SDS-PAGE與Westernblot電泳鑒定表達產(chǎn)物，用鎳離子親和層析的方法對表達產(chǎn)物進行純化。 結(jié)果:PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示約1.50bp的條帶，與預(yù)期大小一致。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，篩選出陽性克隆，質(zhì)粒提取后雙酶切鑒定及瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果得到兩條大小分別為150bp和5.9kb的電泳條帶，與

3、pedA基因和pET-32b(+)質(zhì)粒片段大小相符。大腸桿菌工程菌，在IPTG誘導(dǎo)下表達分子量為19kDa左右的融合蛋白。SDS-PAGE分析顯示，表達的蛋白主要以可溶的形式存在于菌體裂解液上清組分中，表達量為25％。用鎳離子親和層析的方法純化后行SDS-PAGE，目的蛋白呈單一條帶，薄層掃描分析證明，純度達90％。 結(jié)論:成功構(gòu)建了原核表達載體pET-32b(+)/pedA，pedA基因片段編碼的PediocinPA-1能在原